HPLC法检测血清中伏立康唑含量范文

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【摘要】目的建立人体血清样本中伏立康唑含量检测方法。方法色谱柱为依利特C18柱（5μm，4.60mm×200mm）；流动相为水：乙腈：冰醋酸：三乙胺＝64：36：0.1：0.05；流速：1.2ml/min；检测波长:258nm。结果伏立康唑在0.14～13.96μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系，r=0.998。结论实验建立的hplc方法可以用于血清样本中的伏立康唑含量检测。

【关键词】伏立康唑血清样本HPLC含量测定

【Abstract】ObjectiveToestablishamethodtodeterminatethevoriconazolecontentinhumanserumsamples.MethodsEliterC18column（200mm×4.6mm,5μm）wasusedwiththemobilephaseofwater-acetonitrile-aceticacid-triethylamine（64:36:0.1:0.05）.Theflowratewas1.2ml.min-1andthewave-lengthwas258nm.ResultsThecalibrationcurvewaslinearintherangeof0.14-13.96μg/ml（r=0.998）.ConclusionTheestablishedHPLCmethodcanbeusedinthedeterminationofvoriconazolecontentinhumanserum.

【Keywords】voriconazole;serumsample;HPLC;determination

伏立康唑（voriconazole,VRC）是一个三唑类抗真菌药物，其作用机制是抑制真菌细胞色素p450依赖的14α-固醇脱甲基酶，而本品对于真菌细胞色素p450酶比对各种哺乳动物的细胞色素p450酶系统更具选择性。伏立康唑在0.03～64μg/ml的浓度范围内对几乎所有的实验真菌，包括致病性酵母菌和丝状菌属及双芽生菌的分离菌株均有作用。对一些条件致病真菌如曲霉菌属、隐球菌属及念珠菌属包括对氟康唑耐药的克柔念珠菌均有抗菌活性。本实验旨在建立血清样本中伏立康唑浓度检测方法。

1实验材料

伏立康唑对照品，中检所提供。卡马西平对照品，中检所提供。乙腈：色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心，批号：20051120。冰醋酸：分析纯，天津市化学试剂三厂，批号：20061228。三乙胺：分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂，批号：20040806。

Waters515高效液相泵，717自动进样器，996紫外检测器，Empower色谱工作站。

2色谱条件及血浆样本处理方法［1～4］

2.1色谱条件色谱柱为依利特C18柱（5μm，4.60mm×200mm）；流动相为水：乙腈：冰醋酸：三乙胺＝64：36：0.1：0.05；流速：1.2ml/min；检测波长：258nm；柱温：室温。

2.2标准液制备精密称取伏立康唑对照品0.0340g，加甲醇溶解于50ml容量瓶中并稀释至刻度,即得698μg/ml的伏立康唑对照品溶液。精密称取卡马西平对照品0.0050g，用流动相溶于100ml容量瓶中并稀释至刻度，即得50μg/ml的内标溶液。

2.3血浆样品的处理取血浆0.2ml，内标10μl（卡马西平50μg/ml），混匀，再加入0.5ml甲醇，旋涡振荡0.5min，16000r/min离心5min;吸取上清液100μl进样。3方法学研究

3.1专属性在选定的色谱条件下，伏立康唑与内标卡马西平完全分离，且峰形良好，两者保留时间分别约为8.4min和5.4min，空白血浆、空白血浆加药物及内标、含药血浆加内标按4法处理后，色谱图见图1。Ⅰ:空白血浆；Ⅱ:空白血浆加药；Ⅲ:含内标血浆；IV：2号受试者用药后2h色谱图

A：卡马西平,B：伏立康唑

图1伏立康唑色谱图3.2标准曲线及线性回归方程用伏立康唑对照品溶液（698μg/ml）配制标准曲线工作液：将698μg/ml对照品溶液依次用流动相稀释，得到2.79、8.37、27.92、55.84、139.60、279.20μg/ml。

取空白血浆0.19ml分别置于系列试管中，分别加上述标准曲线溶液各10μl，配制成血浆浓度为样，按上0.14、0.42、1.40、2.79、6.98、13.96μg/ml的血浆标述4方法处理血浆样品，测定样品及内标的峰面积，计算其峰面积比值（伏立康唑/卡马西平，A），以峰面积比值A对血浆浓度C进行线性回归分析，求得线性回归方程为：C=5.117A+0.024（w=1/cc），r=0.998。结果表明，伏立康唑血浆浓度在0.14～13.96μg/ml浓度范围内，线性关系良好，血浆样品可进行定量检测的最低浓度为0.14μg/ml。见图2。

图2伏立康唑血浆标准曲线

3.3绝对回收率各取空白血浆0.19ml于15个空白试管中，5个为一组，分别加入8.37μg/ml（低浓度）、55.84μg/ml（中浓度）、139.60μg/ml（高浓度）伏立康唑对照品溶液10μl。得浓度为0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血浆样品。按上述4方法处理血浆样品，进样100μl，记录色谱峰面积。

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bsp;另外，用纯水代替血浆重复以上步骤，记录色谱峰面积。以此为标准，将两组峰面积进行比较，计算伏立康唑的绝对回收率，结果见表1。

3.4相对回收率试验各取空白血浆0.19ml于15个空白试管中，5个为一组，分别加入8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑对照品溶液10μl，得浓度为0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血浆样品。按上述4方法处理血浆样品，进样100μl，记录色谱峰面积的比值。将比值代入标准曲线，与理论值进行比较，计算伏立康唑的相对回收率，结果见表1。

3.5精密度试验取空白血浆0.19ml置于离心管中，分别加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑对照品溶液各10μl，按上述4血浆样品处理方法处理后，得血浆浓度为0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血浆标样各15份，按上述4方法处理血浆样品，于同日和连续2日内各进样100μl，测定样品和内标的峰面积，计算其峰面积比值（A），并按回归方程求出对应浓度，以此计算其日内和日间变异，结果见表2。表1回收率试验表2精密度试验

3.6稳定性试验取空白血浆0.19ml置于离心管中，分别加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑对照品溶液各10μl，得血浆浓度为0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血浆标样各20份，分别于配制后立即、室温放置4h后，24h后反复冻融三次和1个月后，按上述4血浆样品处理方法处理，测定样品和内标的峰面积，计算其峰面积比值（A），并按回归方程求出对应浓度并比较测定浓度，以考察样品稳定性。结果见表3。

4结果

测定血清样品中均匀加入低、中、高对照样品，以评价测定结果的准确性。配制方法：取空白血浆0.19ml置于离心管中分别加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑对照品溶液各10μl，得血浆浓度为0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血浆标样，按上述4血浆样品处理方法处理后，进样100μl，结果见表4。

5结论

本实验建立起的HPLC检测伏立康唑血清样本含量的方法可行，检测的数据真实可靠，可以作为血清样本中伏立康唑含量测定方法。表3样品稳定性试验表4血清样品中伏立康唑检测结果

【参考文献】

1国家药典委员会.中华人民共和国药典,2005版.北京:化学工业出版社,2005，附录：28-30.

2DominiqueLeveque,YasmineNivoix,FrancoisJehl,etal.Clinicalpharmacokineticsofvoriconazole.InternationalJournalofAntimicrobialAgents,2006,（27）:274-284.

3GSrinubabu,ChAIRaju,NSarath,etal.DevelopmentandvalidationofaHPLCmethodforthedeterminationofvoriconazoleinpharmaceuticalformulationusinganexperimentaldesign.Talanta,2007,（71）:1424-1429.

4St''''ephanieChhun,ElisabethRey,AgnesTran,etal.Simultaneousquantificationofvoriconazoleandposaconazoleinhumanplasmabyhigh-performanceliquidchromatographywithultra-violetdetection.JournalofChromatographyB,2007,（40）:001-006.新晨