黄磷亚砷酸钠亚急性肝损害大鼠肝脏酶组织化学定量Ⅰ线粒体标志酶变化范文

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关键词：黄磷；亚砷酸钠；毒性；肝疾病；组织细胞化学；酶学；疾病模型，动物；大鼠

在中毒性肝损害中线粒体作为毒物作用的“靶细胞器”，对各种毒物非常敏感，其生化功能首先受到干扰，最后导致其结构破坏［1，2］。镁ATP酶(Mg2+-ATPase)，单胺氧化酶(MAO)，琥珀酸脱氢酶(SDH)，细胞色素氧化酶(CO)作为线粒体内外膜标志酶，经组织化学(组化)方法原位显示酶的活性，并定量观察中毒性肝损害时酶活性的动态变化对评价毒物的毒理作用及各种毒物不同的作用特点具有重要意义。本研究通过对黄磷，亚砷酸钠中毒大鼠肝脏上述酶的组化染色，利用图像分析技术对肝小叶各区带酶活性定量测定，并结合光镜及电镜下毒物结构损害的特点［3］，探讨黄磷和砷肝损害的酶学特点及其中毒机制。

1材料与方法

1.1试剂与仪器ATP二钠盐(中科院上海生化研究所)；丁二酸钠(上海试剂一厂)；细胞色素C(Sigma公司)；盐酸色氨(Serva公司)；氯化硝基四氮唑蓝(上海前进试剂厂)；二氨基联苯胺(Sigma公司)；Histostat低温冷冻切片机(美国)；图像分析仪(德国)。

1.2动物分组与染毒方式健康雄性大鼠90只，体重(267±32)g，常规饲养，随机分为三组，每组30只。黄磷(P组)1.5mg/kg溶于芝麻油，亚砷酸钠(As组)20mg/kg，溶于水；大鼠灌胃染毒，剂量为每100g体重0.2ml，每周三次，连续12周。对照组给予等体积的芝麻油。

1.3酶组化及图像分析方法染毒后每2周各组随机抽取大鼠5只，放血处死。取出肝脏立即在右肝正中切取5mm×5mm×3mm组织块，“AO”低温冷冻切片机在-15℃下切成10μm厚切片。继而入新配制的孵育液作孵育等系列处理，甘油明胶封片。同时作去底物空白对照。Mg2+-ATPase，SDH，CO，MAO组化均采用经典方法［4］，并经本研究室改良。标本次晨作图像分析处理。在荧光屏直视下划出肝小叶及其区带。该图像分析以光密度(OD)值表示染色的深线，光密度值大表示酶活性高。中央静脉区参数为OD1，中间带为OD2，周围带为OD3，全小叶为ODt。各组选取第2，4，10，12周标本5只，每一标本随机取5个视野。所得参数由计算机作统计处理，多样本均数的两两比较用方差分析，方差不齐者用秩和检验。

2结果

2.1Mg2+-ATPase的变化该酶活性主要位于肝小叶周围带，反应颗粒呈棕褐色点状和线状(封四图1)。砷染毒早期(2～4周)，OD1酶活性增高(封四图2)；黄磷组则各区带酶活性下降(封四图3)，其后(10～12周)两组酶活性均下降。详见附表。

与对照组同期比较：1)P＜0.05；P＜0.01

2.2SDH的变化对照组反应为紫蓝色甲颗粒，主要定位于肝小叶OD3，OD1相对较低，P，As染毒后，酶活性普遍下降(各时间组ODt与对照组比较，P＜0.05)，但OD1酶活性均无明显影响(P＞0.05)。

2.3MAO的变化反应物为紫色，对照组主要分布在周围带。P，As染毒后ODt和OD3下降明显，但As组12周较10周酶活性增高(41.27±5.976vs35.17±9.254，P＜0.05)。

2.4CO的变化反应物为棕色颗粒，对照组主要位于肝小叶周围带，从中央带到周围带酶活性梯度递增。在染毒早期(2～4周)各区带酶活性无明显变化。P组10～12周OD3活性下降(P＜0.05～0.01)，As组12周OD1酶活性增高(40.42±8.607vs32.48±8.896)，P＜0.01)，其它区带变化不明显。

3讨论

3.1肝小叶中酶活性的正常分布及意义经典肝小叶作为一古老概念，由于光镜下边界清楚，现仍用于教学和科研中。“肝腺泡”的引入无疑对肝功能的结构基础解释更为完善，对肝脏病理和毒理研究有重大意义［5］。将肝小叶分为三个区带，基本上与肝腺泡结构吻合。小叶中央带相当于6个单腺泡的第Ⅲ带；周围带相当于6个单腺泡的第Ⅰ带，只是门管区周围包括了腺泡3个带的部分肝细胞。肝小叶周围带集中大量的线粒体，其标志酶含量极丰富，是生物氧化过程的主要场所；也最先接触毒物。而中央带富含混合功能氧化酶［6］，是药物(毒物)代谢的场所，肝细胞营养条件差，最受到药物(毒物)的损害。

3.2黄磷、砷对肝酶系统的损害特点及其机制Mg2+-ATPase活性主要分布在胆小管，其次为线粒体，核膜及质膜。本组砷染毒2周，中央带Mg2+-ATPase，活性增高，第4周更为明显；10周开始回落，12周酶活性下降明显；而周围带持续下降。光镜下发现，2～4周中央带肝细胞浊肿变性；电镜下线粒体肿胀，嵴膜完整清晰，胆小管轻度扩张，10周线粒体基底密度降低，部分膜破裂［3］。此时，光镜下可见点状坏死，炎性细胞浸润。提示砷中毒早期，胆小管及线粒体Mg2+-ATPase活性代偿性增强。而砷中毒早期，砷的排泄除肾外，主要经胆道由粪便排出，因此，Mg2+-ATPase活性增强可能是机体中毒早期的一种解毒机制。以后随着胆小管和线粒体结构的破坏、酶活性降低。黄磷对Mg2+-ATPase的损害无选择性，各区带酶活性下降程度大于砷组。光镜下，2周即出现细胞脂变，10周出现小片状坏死；电镜下胞质含有大量脂滴及次级溶酶体，部分线粒体膜破坏、嵴溶解［3］，说明脂质过氧化作用损害了线粒体及其它生物膜结构。同样，黄磷也使周围带MAO，SDH活性下降，与张弘［2］报道的酶学变化相吻合。

然而，黄磷和砷对中央带SDH无明显影响则可能是OD1区SDH分布量甚少或毒物对其不敏感之故。砷作为氧化磷酸化的解偶联剂，对琥珀酸介导的呼吸无明显影响［7］。砷组晚期MAO活性有回升则可能为细胞对砷产生耐受后酶活性部分恢复所致。黄磷组仅晚期外周带CO活性下降，结合上述结构改变，考虑为中毒早期CO对黄磷不敏感。砷中毒晚期中央带CO活性增高，可能是砷干扰了线粒体氧化的“外途径”，从而激活了“内途径”使CO活性增高以满足ATP生成的需要［8］。

此外，从光镜及酶组化发现：同一个体肝脏一定部位，中毒后不同的肝小叶其结构及酶活性损害程度不同。同一小叶不同区带其损害也不尽相同。电镜下还观察到，同一区带内不同的肝细胞其结构损害差异亦很大。这种差异性，说明了肝细胞生理功能与细胞结构内在

联系的复杂性，其组织学及病理学意义有待进一步探讨。

参考文献

1刘起展.黄磷引起肝脏损害机理及部位的研究.遵义医学院学报，1991，(1)：10～14

2张弘.砷、磷、四氯化碳肝损害酶学指标的比较研究.中华劳动卫生职业病的杂志，1991，(1)：26～29

3詹道友，卢迪生，韩英士，等.黄磷、砷肝损害的电镜和微体酶细胞化学比较研究.湖南医科大学学报，1993，18(3)：243～246

4陈啸梅.组织化学手册.北京：人民卫生出版社，1982.128

5顾长海.肝腺泡学说的概念及其意义.国外医学*消化分册，1984，4(2)：79

6汤平涛.磷、砷、四氯化碳肝损伤线粒体和微粒体乳酸脱氢酶同工酶的改变.中国药理学与毒理学杂志，1992，(4)：292～296

7FowlerBA.Ultrastructuralandbiochemicaleffectsofprolongedoralarsenicexposureonlivermitochondriaofrat.EnvironHealPersp,1977,19:197～204

8FowlerBA.KineticalterationsofcytochromeCoxidaseincarbontetrachlorideinducedcirrhoticratliver.LifeSciences,1987,41(6):741～748新晨