内源性大麻素疼痛调节机制范文
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大麻素系统作为一个主要的神经化学系统，对其功能的探讨是最近才开始的。起初大麻素受体的发现、克隆和鉴定以及这些受体的内源性配体如anandamide和2-AG的分离证实了内源性大麻素神经调节系统的存在。后来发现大麻素受体在啮齿类的大脑中高表达(>1pmol/mg蛋白)以及大麻素受体在中枢神经系统的分布不均匀。后者是外源性大麻素介导镇痛行为效应的神经解剖学基础。集中分布在神经解剖区域如中脑导水管周围灰质（PAG），延脑头端腹内侧(RVM),和脊髓背角的大麻素受体对疼痛信号的传导和调节起作用。所有这些发现表明内源性大麻素在中枢神经系统疼痛调节信号通路中起重要作用。本文将集中阐述大麻素和内源性大麻素在棘上水平介导的疼痛调节功能。
大麻素受体亚型
已证实大麻素受体有CB1和CB2两种亚型，前者集中分布在大脑。相反后者在中枢神经系统神经元中浓度很低，其主要在免疫系统包括脾、扁桃体、单核细胞、T细胞和B细胞中表达[1,2,3]。在病理性疼痛状态下，在腰段背角出现小胶质细胞活化的同时亦检测到了CB2mRNA。CB1通过Gi/o蛋白与腺苷酸环化酶呈负性耦联。这些受体的激活抑制N-和P/Q-型钙离子通道并且激活钾离子和钾A内流通道。CB2也同腺苷酸环化酶负性耦联，但不与钙离子通道耦联。这些信号转导特点说明CB1的激活通过调节钙和钾离子电传导来抑制神经兴奋性和神经递质的释放。
本文将阐述支持内源性大麻素在中枢神经系统通过作用于CB1受体调节疼痛的证据。关于脊柱和外周水平CB1受体的激活在调节急性和持续性疼痛中的作用，已有综述发表。近来已通过全身和局部后肢注射CB2受体选择性激动剂证实了外周CB1和CB2受体在调节急性组织损伤和急性神经损伤性疼痛中的作用。使读者感兴趣的是近来关于外周大麻素镇痛机制的综述。
内源性大麻素的成员及其合成
大脑中一些被公认的内源性大麻素已被分离，包括anandamide、2-AG、noladinether、virodhamine和N-arachidonoyldopamine(NADA)。其他内源性大麻素类化合物包括相关的脂肪酸衍生物oleamide、palmitoylethanolamide和一个新的arachidonoyl氨基酸家族。这些物质缺少与大麻素受体的亲和力，但却能促进内源性大麻素的功能。我们对这些后来发现的化合物的功能还知之甚少并且这超出了本文所涉及到的范围。因为在目前分离出的内源性大麻素中2-AG和anandamide最具代表性，故本文着重了解这些内源性大麻素在疼痛调节中的作用。
Anandamide和2-AG[5,6,35]是在需要时产生（例如，由膜脂前体活性依赖性或受体刺激性分解所产生）并在产生后立即从细胞释放。在体外anandamide的合成分两步第一步，磷脂前体N-arachidonoyl-phosphatidylethanolamine(NAPE)通过Ca2+和cAMP依赖性机制由磷脂酰乙醇胺产生，该过程由N-酰基转移酶催化。第二步，我们认为NAPE由NAPE特异性磷脂酶D水解――该酶还没有在分子水平定性――产生anandamide和phosphatidicacid的代谢中产物。在体外anandamide和CB1有优先亲和力(Ki[CB1vsCB2]=89vs371nM)，而对于vanilloidTRPV1受体anandamide只是种低亲和力的激动剂[4,5]。全身给予外源性的anandamide可以产生镇痛效应，这说明内源性大麻素或许也可以在生理条件下镇痛。然而该效应不能很好的被选择性CB1拮抗剂SR141716A(利莫那班)所阻断，这可能是由于anandamide在体内很快被FAAH代谢成乙醇胺和花生四烯酸。体外实验表明2-AG的生成经过两种酶的连续激活。首先，通过磷脂酶C水解膜磷酸肌醇生成2-AG的前体1,2-甘油二酯(DAG)。新生的DAG随后被DAG脂肪酶（DGL）水解生成2-AG。DAG可以被DAG激酶选择性磷酸化生成磷脂酸。在脑薄片和培养细胞，2-AG的生成可能需要神经活动、膜去极化或者G蛋白耦联受体如I型亲代谢性谷氨酸盐（mGlu5）受体药理激活的刺激。2-AG是种自然存在的2-单酰基甘油，可以激活CB1和CB2受体。虽然脑中2-AG的浓度是anandamide的170倍还多，但我们对内源性2-AG疼痛调节作用的认识才刚刚开始。由于大麻素受体主要作为2-AG受体起作用，我们假定2-AG是大麻素受体的真正天生配体。在甩尾试验中，全身给予外源性2-AG可以抑制有害刺激诱导的应答,这表明内源性大麻素可能在生理状态下抑制疼痛应答。单独给予与2-AG相关的内源性2-酰基甘油在任何实验中都表现不出有意义的活性，但它可以加强2-AG引起的行为应答。在中枢神经系统，这种“随从效应”或许在帮助调节内源性大麻素的活性：通过竞争相同的水解酶可能会增强内源性大麻素的作用。
内源性大麻素降解酶
尽管存在催化在体2-AG水解的单酰基甘油脂肪酶，但五种被公认的内源性大麻素中的三种——anandamide、2-AG和NADA——更易被FAHH（脂肪酰胺水解酶）降解[6]。用免疫细胞化学法标记FAAH在脑中的分布。FAAH和CB1mRNA在解剖学上的对应也支持了内源性大麻素类是抑制性信使的假说。近来电生理研究也证实了这一假说。有意义的是，免疫组化已证明FAAH在丘脑腹后外侧核表达，该区域正是脊髓丘脑束的终止带。这条通路是上传疼痛信号到脑的主要途径。此外，Lissauer束和脊髓背角表面神经元（如，与痛觉初级传人终止带非常靠似）的FAAH被证实是相同的。这些发现证实了内源性大麻素的灭活机制存在于中枢神经系统涉及到痛觉加工的区域，同时更进一步支持了内源性大麻素在疼痛调节中起作用的假说。
虽然据报道在体外FAAH降解2-AG，但似乎MGL在2-AG的灭活中起主导作用[7]。MGL作为一种丝氨酸水解酶将甘油一酯转化成脂肪酸和甘油。RNA印迹、免疫组化和原位杂交研究显示MGL在鼠脑分布不均匀，其中在皮层、丘脑、海马和小脑中水平最高。超微结构研究显示MGL即使不是唯一也是主要集中分布在轴突终末。最近，对MGL药理抑制剂如URB602的更进一步研究为研究内源性2-AG在疼痛调节中的作用提供了药理工具，见下文。体外研究显示MGL的过度表达会减弱2-AG在鼠脑皮层神经元中的积聚，而不改变anandamide的积聚。此外，在Hela细胞，病毒诱导MGL的RNA沉默会伴有2-AG的基础浓度和Ca2＋刺激后浓度的显著增加。在鼠皮质纹状体和海马切片获得的培养细胞，mGlu5受体的激活会刺激2-AG（而不是anandamide）生成。该2-AG的生成是钙离子依赖性的并且可以被磷脂酶C和1,2-二酰基甘油脂肪酶水解。另外，I型mGlu受体激动剂DHPG生成2-AG可以被亲代谢性谷氨酸盐5（mGlu5）受体拮抗剂MPEP所阻断。然而，我们需要更多的研究证明在体2-AG的生成是否也经历了同样的过程。
外源性2-AG的镇痛作用在FAAH（-/-）鼠中依然存在，这说明FAAH在体内不催化2-AG灭活。不像anandamide和oleamide,单酰甘油脂如2-AG在FAAH（+/+）和FAAH(-/-)鼠中水解活性相同。以这些发现为基础，提出FAAH是在体脂肪酰胺活性的重要调节剂而不是介质。
为了更好的评估内源性大麻素在疼痛调节中的作用，最近在利用药理学方法的同时联合使用了包括FAAH和CB1的基因敲除方法。缺乏CB1基因的突变鼠对于大麻素激动剂不能表现出典型的镇痛应答。然而，我们承认高剂量的Δ9-四氢大麻酚可以表现出非CB1依赖性的镇痛效应，尽管该效应的受体机制还不确定。Cravatt等人继续研究FAAH基因缺乏的鼠并发现这些鼠在给予外源性的anandamide后镇痛作用会加强。重要的是，这种镇痛效应的增强会被CB1选择性拮抗剂利莫那班所阻断。与FAAH(+/+)相比FAAH(-/-)鼠行为表型的出现伴随着内源性脑组织anandamide的15倍增加[8]。当给予缺乏FAAH鼠外源性anandamide时，它们会表现出严重的CB1依赖性行为反应，包括运动减弱、痛觉缺失、木僵及低体温。不能合成和灭活2-AG的突变鼠的出现将会更进一步解释这些内源性大麻素在疼痛调节中的作用。
大麻素受体的药理学和外源性大麻素配体
对CB1竞争性拮抗剂和选择性激动剂的更进一步研究为探索大麻素在神经系统的生物功能提供了重要的药理学工具。SR141716(利莫那班)在脑中与大麻素受体有高度的亲和力(Kd=0.23nM)而与CB2(Ki[CB1vsCB2]=5.6nMvs>1μM)的亲和力非常弱[10]。利莫那班在高浓度时表现出抑制vanilloidTRPV1(前VR1)受体。AM251是一种选择性、竞争性CB1拮抗剂(Ki[CB1vsCB2]=7.5nMvs>2μM)且没有vanilloid活性。有效的大麻素激动剂CP55940(Ki=0.6nMatCB1andCB2)、HU210(Ki[CB1vsCB2]=0.73vs0.22nM)和WIN55212-2(Ki[CB1vsCB2]=1.9vs0.3nM)与CB1、CB2有高亲和力并且与经典大麻素原型Δ9-四氢大麻酚(Δ9-THC)相比效能有显著改善。选择性竞争性拮抗剂和高亲和力的拮抗剂都被用来研究大麻素在痛觉信号转导中的作用和内源性大麻素的神经系统起作用的位置。
对直接激活或是阻断大麻素受体的外源性化合物进行研究对于初步估计大麻素受体激活在疼痛调节中的功能是必不可少的。然而，这些研究没有提供直接的证据支持内源性大麻素在生理条件下也能发挥相同的功能。近来，对抑制内源性大麻素系统酶降解药物（如，通过抑制FAAH或MGL）的进一步研究使研究机体内源性系统激活所产生的效应变得更容易。URB597是一种极具特征的FAAH不可逆性抑制剂(IC50=4.6nM)，与CB1和CB2受体无亲和力，同并且在浓度高于300μM时不影响MGL、乙酰基-乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶和大麻素的膜转运[9]。Arachidonoylserotonin是种新的FAAH抑制剂，抑制anandamide的水解(IC50=5.6μM),与CB1无亲和力,且对细胞摄取25μM的anandamide无明显影响。MGL可以被许多非选择性的丝氨酸水解酶抑制剂抑制（例如，甲基arachidonoylfluorophosphonate）。更近一些的研究描述了两种选择性MGL抑制剂：URB602和URB754。URB602通过非竞争性机制抑制鼠脑MGL(IC50=28±4μM),不影响FAAH活性和anandamide的浓度,不影响脂类代谢酶类如二酰基甘油脂(肪)酶和COX2的活性，且不影响[3H]-WIN55212-2与CB1和CB2受体的结合(IC50≥5mM)以及[35S]-GTP-g-S与鼠小脑膜的结合。URB754在疼痛调节中的作用还不清楚。
虽然特异性的转运体还没有被克隆，但据报道，细胞摄取anandamide的方式包括异化扩散。Kinetics研究提出存在一种anandamide膜转运体，药理学研究通过使用anandamide转运抑制剂支持了anandamide转运抑制可以调节内源性大麻素的观点。这类药物中最常用的有AM404和VDM11，前者也可以抑制FAAH活性。AM404在低浓度时就可以激活TRPV1受体，而VDM11则不能。VDM11抑制细胞摄取anandamide(IC50=1-11μM)却不影响FAAH,且在生物学适当剂量时不与大麻素受体结合。近来，一种新型有效的anandamide摄取竞争性抑制剂LY2318912被用来在鼠小脑放射性标记anandamide转运体的结合位点[10]。全身给予LY2318912可以使脑中anandamide水平有5倍提高。此外，LY2318912可以减少福尔马林试验中的疼痛行为，而不伴有给予直接大麻素激动剂出现的特有严重运动缺陷。
外源性大麻素类的镇痛效应
采用不同的有害刺激（如，热、机械性和化学性）进行潜伏期行为研究证明了大麻素类可以有效的镇痛。早在1988年，Dixon指出让狗吸入燃烧大麻产生的烟可以使其对针扎不作出反应。Bicher、Mechoulam和Kosersky等人所作的大麻素镇痛研究为随后证实大麻素有效的抑制急性伤害性刺激、炎症和神经损伤所致疼痛的行为反应奠定基础。大麻素在镇痛方面的效能比得上吗啡。然而大麻素导致严重的运动缺陷包括运动受限和木僵，这会影响我们行为学研究中评估有害刺激诱发的运动应答。为了弥补大麻素的这一不足，最近许多对大麻素镇痛的研究增加了对运动受限和木僵的行为评估，这样就可以给大麻素导致的运动应答的改变提供原始对照。然而单靠行为研究还不足以证明大麻素类可以抑制痛觉信号的加工。本文从更多方面证明了大麻素类可以抑制痛觉信号传导，从而为内源性大麻素镇痛机制的存在提供了强有力的证据。
在急性和持久性疼痛动物模型中，通过全身给予大麻素可以有效的证明大麻素类的镇痛效应。给予天然的、合成的或外源性的大麻素所产生的镇痛效应，以及通过药理学和基因学方法不让CB1激活从而阻断前述效应，这些研究结果很好的证明了大麻素类在调节疼痛敏感性方面有着特殊的生理效应。这些研究的局限性在于不能使大麻素的效应局限在某些位点以及不能说明是哪种内源性大麻素参与了疼痛调节。针对第一种局限性，一些研究采用区域特异性的显微注射法将大麻素类注入与疼痛信号加工和调节有关的区域。对于第二种局限性采用微量渗析和液相、气相质谱分析直接对内源性的介质作定性和定量分析，或者采用区域特异性的给予调节内源性大麻素摄取或释放的药物来作间接分析。
大麻素抑制痛信号传导
电生理和神经化学研究为大麻素类抑制在体痛信号传导提供了可靠的证据。Walker实验室首先证明了大麻素类在脊髓和丘脑可以抑制有害刺激诱发疼痛神经元的神经兴奋性。在疼痛神经元观察到的这种抑制，在其他各种有害刺激（机械性、热、化学性）模型普遍存在，它由大麻素受体介导并且与大麻素类的镇痛效应相关。大麻素类在正常、炎症和神经损伤的鼠亦能抑制脊髓背角神经元c纤维诱发的应答。除此之外，在多种持久性痛动物模型中大麻素类通过CB1和CB2选择性机制抑制脊髓中标志持续性神经兴奋的神经化学物质Fos蛋白的表达。许多电生理研究集中在脊髓背角水平的广动力范围神经元和疼痛特异性细胞，这些研究为大麻素类抑制痛信号传导提供可靠证据。脑干神经元的在体电生理研究涉及到的痛觉下调也为证明大麻素类的疼痛调节作用提供依据，我们将在下文中讨论[11,12]。
在组织损伤致持续性痛模型中大麻素的镇痛效应
研究证明全身给予大麻素可以对多种炎症致疼痛模型起到镇痛作用。Kosersky等人指出在后爪炎症后给予Δ9-THC可以增加爪受力致发声的阈值。Tsou等人采用福尔马林试验指出全身给予大麻素类会抑制有害刺激诱发的Fos蛋白表达和疼痛相关性行为。通过福尔马林试验对棘上水平组织加工的疼痛行为进行评价。Hohmann的实验室证明脊髓下行去甲肾上腺素能投射纤维的神经毒性损害可以减弱WIN55212-2对福尔马林诱发Fos蛋白表达的抑制[13]。目前已很好的证明了在组织和神经损伤造成的持续性痛模型中，外周和脊髓的大麻素镇痛位点在其镇痛中的贡献。相反，在持续性痛模型中大麻素在棘上水平的作用位点在其镇痛中的贡献却被关注的很少。
在神经损伤致持续性痛模型中大麻素的镇痛效应
已在一些实验性神经病变啮齿动物模型中证实大麻素类有抗痛觉过敏和抗异常疼痛作用。Bennett实验组证实了大麻素在坐骨神经慢性缩窄性损伤后的抗痛觉过敏和抗异常疼痛作用。全身给予一种CB1受体拮抗剂可以阻断上述改变。全身给予WIN55212-2可以缓解紧扎L5脊神经导致的痛觉过敏和异常疼痛；这些效应可以被CB1拮抗剂而不是CB2拮抗剂所逆转。在神经损伤鼠大麻素在重复给药后依然有镇痛作用，这说明大麻素在缓解神经性疼痛方面要优于阿片类。在脊神经根切断术后大量脊髓大麻素受体依然完整，这或许有临床意义，尤其是对耐受传统麻醉性镇痛药的去传人疼痛来说更由意义。因此实验研究支持大麻素类作为一种新方法治疗神经性疼痛。
通过大麻素诱导的windup抑制和有害刺激诱导的中枢致敏证实了在神经性疼痛中大麻素类抗疼痛过敏作用的一种可能机制。最近，通过在鼠神经病变模型采用鞘内和脑桥内注射大麻素激动剂和拮抗剂的方法证明了中枢和外周都存在大麻素抗疼痛过敏效应的作用区域。电生理研究通过紧密结扎L5/L6脊神经的方法也为证明脊髓大麻素系统具有可塑性提供依据。大麻素系统的可塑性或许可以为大麻素治疗神经性疼痛作出贡献。然而我们对棘上大麻素镇痛位点在控制神经性疼痛中可能存在的贡献还知之甚少。
网状巨核细胞parsalpha参与了大麻素对神经性疼痛的调节。将鼠坐骨神经部分结扎(Seltzer模型)，给神经损伤的对侧后肢注射福尔马林后的行为反应与无神经损伤的对照组相比要轻微。给予神经损伤鼠的网状巨核细胞parsalpha利莫那班后其对福尔马林的行为反应会增强。虽然这些结果与福尔马林试验中神经损伤通过网状巨核细胞parsalpha激活CB1来介导内源性镇痛机制的假说一致，但是反激动剂效应会使解释用利莫那班评估大麻素效应变得复杂[14]。我们需要更进一步的研究以确定是否是内源性大麻素介导了这些观察到的结果并且确定那种特殊的内源性大麻素在镇痛效应中的生理学作用。
棘上位点参与大麻素的疼痛调节
最初是在评估热刺激引发的急性退缩反应的研究中报道了支持存在大麻素镇痛的棘上位点的直接证据。在甩尾试验中脊髓横断后Δ9-THC的镇痛作用会减弱，这间接证明了棘上位点在大麻素镇痛作用中起重要作用。神经电生理研究同样也证实了全身给予大麻素类对有害刺激诱发脊髓疼痛神经元反应的抑制作用会在脊髓横断后减弱。在心室内给予大麻素类WIN55212-2、CP55940和D9-THC可以镇痛的研究结果直接证明了存在大麻素棘上镇痛位点。与这些行为学研究一致，心室内给予WIN55212-2后也可以在脊髓背角记录到有害刺激诱发的广动力范围神经元应答被抑制。在心室内注射[3H]WIN55212-2后采用放射自显影技术发现放射性标记药物局限在整个大脑的脑室周围。这些研究强调了脑室周围结构在大麻素介导的疼痛调节中的重要性。
通过给脑干位点特异性的注入大麻素激动剂来定位大麻素镇痛的棘上位点。其他研究用甩尾试验也证明了将大麻素类显微注射在在诸如背外侧PAG、背侧脊核、RVM、杏仁核、丘脑的后外侧及submedius区域、上丘和去甲肾上腺素能的A5区都可以产生镇痛。Lichtman等人证明在腹后外侧PAG/背侧脊核附近给予CP55940也可以产生镇痛、木僵和低体温，其中是否产生低体温可以作为选择活性立体异构体的标准。相反给予尾状壳核CP55940也可以产生木僵但不会产生镇痛和低体温。在PAG背侧显微注射大麻素HU210也可以抑制福尔马林诱发的CB1介导的抗伤害行为和减少PAG尾部外侧福尔马林诱发的Fos蛋白表达。PAG内注射大麻素也可以减弱PAG背角注射兴奋性氨基酸D,L-同型半胱氨酸引发的有害性防御行为(例如，运动器激活)。在鼠，外源性大麻素通过作用于背角PAG也可以调节超声诱导的伤害应答，尽管这些效应对于利莫那班的阻断作用不敏感。这些研究支持了内源性大麻素类可能是通过作用于PAG来调节疼痛和防御行为的假说。虽然这些研究描述了外源性给予合成大麻素产生的上述镇痛作用位点，但是他们没有阐明是哪种内源性大麻素类在疼痛调节中起了作用。对于混合物诱导镇痛效应，研究者通常假定其中一种特殊内源性大麻素的作用。这种方法亦假定了适当的刺激可以使这种内源性大麻素在体内释放且这种化合物的网络效应足以抑制疼痛敏感性。在其他研究中研究者将内源性大麻素的浓度或释放与观察到的镇痛效果相关联。这种方法虽然提供了一些信息但不能建立因果关系。带着这些想法，接下来介绍镇痛应答中特定内源性大麻素的作用。
PAG
PAG是产生镇痛和伤害应答的共同神经基质。电刺激PAG产生的镇痛和防御行为依赖PAG核团某些特殊部分的激活。电刺激PAG腹外侧产生的镇痛可以被阿片拮抗剂如naltrexone所阻断，这表明内源性阿片肽参与了这一过程。相反，电刺激PAG背侧和外侧核产生的镇痛却对阿片拮抗剂的阻断作用不敏感，该过程由内源性大麻素介导可被大麻素拮抗剂阻断。Walker实验组提出电刺激PAG背侧和外侧核导致大麻素受体介导的镇痛与大麻素的动员同时发生。这些作用可被全身给予或PAG内显微注射利莫那班所拮抗，这符合该反应由CB1介导。Hohmann等人最近证明了伴随非阿片应激性镇痛(SIA)的表达，中脑背侧包括整个PAG中的2-AG和anandamide浓度会升高。他们指出经过3分钟持续足电击可以产生CB1介导的非内源阿片依赖性应激性镇痛（SIA）。此外，显微注射FAAH抑制剂如URB597和arachidonoylserotonin也可以增强CB1依赖性SIA。在PAG显微注射MGL抑制剂URB602也可以使该区域CB1介导的应激性镇痛增强且选择性的使2-AG的浓度升高(而不是anandamide)。这些结果证实了在中脑PAG水平内源性2-AG在疼痛调节中的生理作用。
内源性大麻素的作用不都是通过CB1受体介导的，因此很有必要证明内源性大麻素的作用是被选择性的大麻素拮抗剂所阻断的。有报道指出在PAG腹外侧核显微注射FAAH抑制剂URB597可以使内源性大麻素的水平升高(anandamide和2-AG都包括)，且通过CB1和TRPV1受体的激活对热伤害产生双相作用。该研究中，注射URB597产生的TRPV1介导的镇痛和CB1介导的疼痛与RVMoff-cells活性的强弱相关,这表明这些效应的产生是分别通过刺激和抑制PAG兴奋性输出神经元而产生的。然而经测试用最高剂量的URB597(4nmol/rat)和WIN55212-2(25-100nmol)只会产生CB1介导的与刺激RVMoff-cells(可能是去抑制)有关的镇痛。因此,可能是anandamide而不是2-AG通过选择性的作用于PAG亚区的CB1或TRPV1受体影响了疼痛调节的下行通路。
体外电生理研究指出在鼠PAG，大麻素类通过CB1特异性机制在突触前抑制gamma-aminobutyricacid-ergic(GABAergic)和glutamatergic的突触传递。大麻素类对细胞的作用与μ阿片类不同，因为大麻素类缺乏对PAG神经元突触后的直接作用。外源性大麻素类可能通过Ca2+依赖性机制降低轴突终末递质释放的几率，这表明内源性大麻素在生理状态下以同样的机制起作用。大麻素在PAG水平的镇痛作用需要亲代谢性谷氨酸盐受体和N-methyl-D-asparticacid(NMDA)受体的参与。在跖肌试验中给PAG注射WIN55212-2可以产生剂量依赖性的爪回缩潜伏期的延长[15]。预先给予利莫那班可以阻断该镇痛效应，而利莫那班在高剂量时也可以产生适度的痛觉过敏。
阻断mGlu5亲代谢性谷氨酸盐受体而非mGlu1受体会完全阻断WIN55212-2的作用。mGlu5和mGlu1受体均属于I型亲代谢性谷氨酸盐受体，两者是G蛋白耦联受体且与磷脂酶C正性耦联。Ⅱ型(包括mGlu2和mGlu3)和Ⅲ型(包括mGlu4,mGlu6,mGlu7,和mGlu8)亲代谢性谷氨酸盐受体与腺核苷酸环化酶负性耦联且主要集中在突触前与自身受体联合的活化区域，用这两型受体拮抗剂作预处理也可以抑制WIN55212-2诱导的镇痛效应。除了这些亲代谢性谷氨酸盐受体，ionotropicglutamate(NMDA)受体的一种选择性拮抗剂也可以阻断WIN55212-2的镇痛效应。还需要更多的研究来解释亲代谢性谷氨酸盐受体在内源性大麻素镇痛机制中的作用。
RVM
研究者把目标集中在其他脑干核团如RVM和网状巨核细胞中的人工合成大麻素类，来更好的研究大麻素介导镇痛的位点。Walker研究组证明在甩尾实验中在RVM位点特异性的给予大麻素类(WIN55212-2和HU210)可以产生镇痛效应。HU210的镇痛效应可以被利莫那班阻断，显然该过程由CB1受体介导。而在同样的位点显微注射受体的无活性异构体WIN55212-3却不能产生镇痛。
电生理研究为介导这些疼痛效应的机制提供依据。在体记录提供直接证据支持大麻素调节RVM的on-和off-cells,因此证明这些配体可以通过与吗啡相似的途径控制疼痛的下调信号。在浅麻醉鼠,在甩尾疼痛反射发生之前on-cells表现出阵发快速的兴奋性,从而增强疼痛转导,然而off-cells在甩尾反射发生之前出现冲动发放抑制,从而抑制疼痛转导。大麻素类增强off-cell已经激活的兴奋性且减少off-cell的静歇时间以及减弱甩尾反射发生之前出现的on-cell快速阵发兴奋性，这些作用的机制由CB1介导而不依赖于内源性阿片类物质。位点特异性给予GABAA受体激动剂muscimol使RVM药理性失活也能阻断镇痛效应而不像全身给予WIN55212-2那样出现运动缺陷。这项研究证实大麻素镇痛机制中存在一个γ-氨基丁酸能环节。在细胞水平，大麻素类通过在突触前抑制γ-氨基丁酸能神经传递发挥其在RVM的生理作用。总之，这些研究结果证明内源性大麻素在RVM水平对疼痛应答作以调节，然而是哪种特殊的内源性大麻素介导了该效应还有待于被证实。
RVM中的网状巨核细胞parsalpha代表了大麻素类的主要下调信号发放区并且该细胞可以被有害刺激直接激活。对于其他未作处理的鼠，在甩尾试验和福尔马林试验中在巨核细胞parsalpha显微注射WIN55212-2可以产生镇痛[16]。这些效应可以被CB1拮抗剂阻断。微量渗析研究、高性能液体色谱仪质谱分析法，以及位点特异性的给予内源性大麻素降解和合成的抑制剂,这些方法将会对确定哪一种内源性大麻素介导了这种效应非常有用。
杏仁体的作用
杏仁体是一个核团复合体位于前脑边缘，在协调恐惧反应和防御反应中起重要作用。杏仁体位于最佳的解剖学位置来接受和整合多种形式的感觉信号,并且依次调节对强刺激(特别是危险刺激)作出的情感、自主和躯体运动反应。在杏仁体基底外侧核可以在γ-氨基丁酸能中间神经元亚型中检测到CB1的免疫反应性，该位点参与有害记忆的形成和储存。在条件性恐惧、厌恶模型中，杏仁体基底外侧核的Anandamide和2-AG会增高,这支持了内源性大麻素类天生就可以抑制有害记忆消除的假说。杏仁体基底外侧核的内源性大麻素和CB1受体参与γ-氨基丁酸能抑制性电流的长时程抑制，这表明内源性大麻素通过选择性的抑制杏仁核局部的抑制性信号网络来调节有害记忆的消除。
杏仁核同时在镇痛调节中起重要作用。甩尾试验中在杏仁核基底外侧核显微注射大麻素类可以产生镇痛效应。在辐射热甩尾和福尔马林试验中，杏仁体基底外侧核显微注射μ-阿片激动剂同样可以产生显著的镇痛效果。此外,非人灵长类杏仁体双侧损伤会使其对有效的人工合成大麻素WIN55212-2的镇痛作用不敏感。在啮齿类杏仁体中央核而不是基底外侧核显微注射GABAA激动剂muscimol，可以减弱全身给予WIN55212-2产生的镇痛作用。此外，FAAH和MGL在杏仁体基底外侧和外侧分别集中分布在突触后和突触前。这些研究指出杏仁体基底外侧核存在灭活anandamide和2-AG的机制。条件性的和非条件性的SIA依赖于杏仁体功能的完整。在杏仁体的基底外侧核位点特异性的给予大麻素可以产生镇痛，连同上述结果共同表明内源性大麻素类或许天生具有通过作用于杏仁体来抑制环境所致疼痛的作用[17]。在下文中,Hohmann提供证据支持暴露于环境中的应激源或许可以诱导内源性大麻素类通过作用于PAG、较小范围的RVM和脊髓来产生特异性镇痛效应。
支持内源性大麻素在SIA中起作用的行为学证据
应激使神经系统激活以抑制痛觉，这种适应性反应即所谓的SIA。该反应依赖于杏仁体投射到中脑PAG、下行到脑干RVM和脊髓背角通路的复原。一度认为是内源性阿片肽参与了这一过程，但是阿片拮抗剂不能阻断各种应激源引发的应激性镇痛，这清楚的说明有其他未确认的机制参与了这一反应。
我们假设内源性大麻素类或许参与了短暂、连续足电击诱发的非阿片性SIA。首先，脑中主要大麻素受体亚型CB1的激动剂可以产生很好的镇痛效应且抑制疼痛神经元的兴奋性。其次，CB1拮抗剂增强疼痛性RVM神经元的活性，并且增强对有害刺激的敏感性，这说明存在一种固有的内源性大麻素来调节下行镇痛通路。
在鼠甩尾试验中暴露于足电击应激源后3分钟，定量分析应激后疼痛敏感性。正如之前证明的一样，这种刺激可以产生很好的镇痛，该效应不会因全身注射阿片拮抗剂naltrexone而改变，但却会因全身给予竞争性CB1受体拮抗剂/反激动剂利莫那班和AM251而消失。此外，研究观察到对大麻素类镇痛产生耐受的鼠（连续14天每日给予WIN55212-2），其应激性镇痛显著减弱。这种变化不太可能是由于阿片效应的改变，因为大麻素耐受鼠并没有表现出对吗啡镇痛应答的改变且没有表现出非阿片应激性镇痛的减弱。
在hohmann的试验模型中通过全身给予capsazepine药理性阻断TRPV1也不能改变应激性镇痛，这表明内源性大麻素介导的应激性镇痛不依赖于TRPV1。在甩尾试验中同样剂量的capsazepine不能影响内源性大麻素介导的应激性镇痛，然而却能有效的降低辣椒辣素介导的镇痛。
我们有理由认为如果内源性大麻素激活CB1受体介导非阿片性SIA,那么随后抑制内源性大麻素失活将会增强应激性镇痛。为了证实这一假说,在甩尾试验中hohmann等人给鼠FAAH抑制剂(URB597、arachidonoylserotonin、或是palmitoyltrifluoromethylketone)并检测应激性镇痛的效应。不管采用什么样的药理学方法抑制FAAH,全身给予FAAH抑制剂的动物电击后的SIA是增强的。在所有例子中，这些效应都可以被利莫那班阻断，符合CB1依赖性作用机制。在福尔马林试验中全身给予利莫那班也能减弱条件性恐惧镇痛应答，连同冰冻行为实验，共同表明CB1受体和内源性大麻素类或许也对条件性恐惧镇痛起作用。[18]
内源性大麻素介导SIA的作用位点
为进一步研究内源性大麻素类介导应激性镇痛的作用位点，Hohmann等人通过鼠的甩尾试验在脑脊髓的多个水平显微注射利莫那班并对应激后疼痛敏感性作定量分析。并对参与疼痛应答和应激应答的脑结构包括PAG背外侧核、PAG腹核、RVM、杏仁体基底外侧核、杏仁体中央核以及腰部脊髓作以研究，发现这些结构不仅包含CB1受体，还参与大麻素镇痛效应。在PAG背外侧核显微注射利莫那班与测试的其他位点相比产生对SIA的显著抑制(表3)。这些发现符合在PAG存在CB1受体，并且表明该结构对非阿片性SIA十分重要。
表3.在非阿片性应激性镇痛中dPAG起到重要作用。与vPAG、RVM和对照组相比在dPAG显微注射利莫那班(2nmol)可以对应激性镇痛产生最大程度的抑制(F3,484=96.42,P<.0001)。采用双盲法用电击(0.9mA，3分钟)后甩尾潜伏期评估SIA。dPAG指背外侧PAG;RVM，延脑头端腹内侧;SIA,应激性镇痛;vPAG,腹外侧PAG。
应激动员内源性大麻素类抑制疼痛
为了确定SIA是否涉及到内源性大麻素的释放，对没经足电击处死及足电击后各个时间点处死的鼠的背侧脑干碎片中(包括完整的PAG)anandamide和2-AG的浓度作以测定。液/质色谱(LC/MS)分析法显示中脑2-AG浓度在电击后2分钟显著升高并且在大约15分钟后恢复到基础水平。在电击产生上述应答之后anandamide的浓度持续升高，达到最高值后持续7-15分钟。虽然枕叶皮层含有CB1受体，但却观察不到这样的改变，因此不认为它是SIA回路的一部分。应激后PAG中2-AG浓度迅速升高，这说明是内源性大麻素的释放而不是CB1的固有活性产生了SIA。
Hohmann等人对在PAG的内源性大麻素动员时程和SIA作以比较。发现了这些参数之间有很高的暂时相关性(r=0.943,P.03),这一点符合二者由共同机制介导(表4)。相反，anandamide释放的时程与2-AG的动员和同样时间间隔的SIA截然不同(r=–0.479,P=.26)。这种暂相关说明在非阿片SIA中2-AG是个关键性的介质。新晨