尼莫地平在大鼠体内药物代谢动力学范文
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作者：刘晓兰陈钰瑛刘惠娟
【摘要】目的：探讨鼠血浆中尼莫地平血药浓度的测定及其药代动力学，建立HPLC测定鼠血浆中尼莫地平含量的方法。方法：采用药效——药代统一模型，以及HPLC测定。结果：色谱柱为HyperilC18柱（4.6×200mm，5μm），流动相为甲醇——水（87︰13），流速1.0ml/min，柱温35℃，检测波长240nm。尼莫地平血浆在10～3200ng·ml－1范围，具有良好线性关系，Y=691C＋415，R=0.9998，提取回收率90.4%～103.0%，方法回收率97.0%～105.3%。大鼠灌胃给药10mg·kg－1，20mg·kg－1，40mg·kg－1。血药浓度时间曲线符合一级吸收的二室模型，剂量与AUC，Tmax具有良好线性关系。结论：尼莫地平在大鼠体内的处置属于线性动力学，药物代谢动力学参数与剂量无关。本法稳定简单、可靠，可用于尼莫地平血药浓度分析及药代动力学研究。
【关键词】高效液相色谱法尼莫地平血浓度药代动力学
尼莫地平是一种临床上治疗脑血管疾病广泛应用的钙离子拮抗剂。本实验探讨采用高效液相色谱法测定鼠血浆中尼莫地平血药浓度，建立HPLC测定鼠血浆中尼莫地平含量的方法及其药代动力学。
1材料和方法
1.1药物、动物和仪器药品和试剂：尼莫地平某制药厂生产，尼莫地平对照品（中国药品生物制品检定所），甲醇色谱纯，其他试剂为分析纯。动物：大鼠，体重200～250g，雌雄兼用，由省动物中心提供，给药前禁食过夜。仪器ShimadzuLC-10ADVP液相色谱仪，ShimadzuSPD-10A二极管阵列检测器，Class-VP5.2色谱工作站，ShimadzuLC-6A液相色谱仪，Waters486可变波长检测，SR2000色谱数据工作站（上海三锐科技）。
1.2色谱条件色谱柱：大连依利特Hypersil-C18柱（4.6×200mm，5μm）；流动相：甲醇——水（87︰13）；流速：1.0ml/min，柱温：35℃。测定波长240nm。
1.3对照品溶液的配制取经五氧化二磷60℃真空干燥至恒重的尼莫地平对照品约10mg，精密称定至100ml量瓶中，加氯仿1.5ml溶解，流动相加至刻度，摇匀，即得浓度为100μg·ml－1的对照品溶液。精密量取0.1ml及2ml分别置10ml量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为1及20μg·ml－1的对照品溶液。
1.4大鼠血浆中尼莫地平含量的测定取大鼠血浆1ml加甲醇1ml，旋涡1min，加2mol·L－1碳酸钠溶液100μL，旋涡1min，加环已烷4.5ml，旋涡提取3min，4000rmin－1离心10min，取上清液4ml置另一离心管中，40℃水浴中氮气挥干，进样前用150μL甲醇溶解，进样50μL，外标法以样品峰面积计算生物样品中尼莫地平浓度。
1.5给药剂量选择根据预试验结果，大鼠显效剂量为22.5mg·kg－1；急性毒性试验，灌胃给药，LD50＞2.0g，故选定的试验试量为10，20，40mg·kg－1。
1.6大鼠药代动力学实验实验用大鼠216只，雌雄各半，随机分成3组，每组雌雄各半，实验10，20，40mg·kg－1三个剂组，取尼莫地平适量，精密称定，用0.5%羧甲基纤维素纳配成混悬液，供大量ig给药，给药容量为2ml·100g－1。于给药0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，12，16，24，32h后不同时间大鼠股动脉取血，肝素抗凝，离心分离出血浆，－18℃冰冻保存，每一时间点用6只大鼠，分别测定各鼠的血浆药物浓度。
2试验结果
2.1按“尼莫地平血药浓度测定方法”项下操作，色谱图见图1。尼莫地平的保留时间为8.4min，内源性物质不干扰样品测定。色谱图见图1A为空白，B为体外，C为体内。
2.2稳定性试验将大鼠ig给药后不同时间取样后多作的血浆混合作为稳定性试验样本，进行以下试验：①样品当日提取测定作为基础值，另将同日已提取挥干溶剂的残渣管冷藏（0℃）放置2天后测定。②样品冷冻，-20℃放置，冷冻后第一次融化，取样测定。③已融化过一次的样品再冷冻放置，冷冻一周后第二次融化，取样测定。结果表明：与基础值比较，在3种样品放置条件下，P＞0.05（α=0.02），说明血样处理吹干后，冷藏放置2天内稳定；含药血浆冷冻放置较稳定，冷冻后融化2次对样品含量无影响。
2.3线性关系考察取离心管数支，精密加入不同量的尼莫地平对照品溶液，以空白血浆配成浓度为10、20、60、160、400、800、1600、3200ng·ml-1的标准血浆,按“大鼠血浆中药物浓度测定”项下操作,每种浓度2份,记录峰面积，以尼莫地平峰面积对浓度进行加权回归分析。结果表明尼莫地平在10～3200ng·ml-1范围内线性良好，10mg·kg-1剂量的随行标准曲线回归方程为：A=591C+415,r=0.9998；20mg·kg-1剂量的随行标准曲线回归方程为：A=606C+264,r=0.9997；40mg·kg-1剂量的随行标准曲线回归方程为：A=608C+809,r=0.8887。
2.4提取回收率与方法回收率测定取离心管数支，精密加入尼莫地平不同量吹干溶剂，使含尼莫地平绝对量为60、400、3200ng,加甲醇150L溶解残渣进样分析，得峰面积As。另取空白血浆配成含尼莫地平60ng、400ng、3200ng·ml-1的标准血浆，按“大鼠血浆中尼莫地平浓度测定”项下操作，每种浓度5份，得血样峰面积Ax，血样提取物峰响应值与甲醇配制的相同浓度的尼莫地平
直接进样峰面积比值(4.5Ax/4As×100%)即为提取回收率，将测得的峰面积代入标准曲线得到的浓度除以加入的浓度即为方法回收率。
2.5精密度试验按“线性关系考察”项下操作，配制浓度分别为60、400、3200ng·ml-1的尼莫地平标准血浆进行分析，在同日内用同一条标准曲线及同一台仪器进行分析，测定日内精密度；于试验第1、2、3、4、5天，分别测定其日间精密度，计算日内相对标准差(RSD)和日间相对标准差(RSD)。
2.6灵敏测定逐级降低加入血浆中尼莫地平量，测得尼莫地平在大鼠血浆中的最小检测限I为5ng·ml-1。
3大鼠血药浓度
测定大鼠ig三个剂量后血浆中不同血药浓度，血药浓度时间曲线见图2。将血药浓度一时间数据分别采用3P97程序（中国药理学会数学药理委员会编制）[1]按一级吸收的开放一室模型，一级吸收的开放二室模型，进行模型拟合，判别指标为1.Re=∑（Ci-Ci*）2；2.AIC=NlnRe+2m经模型拟合,根据最小AIC准则,选择二室模型为好。
4讨论
4.1大鼠血药浓度方法建立时，发现在最大波长231nm检测，有来自溶剂中的较小的干扰，选择240nm测定，干扰消失，虽灵敏度有所降低，但方法的灵敏度符合药代动力学要求，故最终240nm作为设定波长。
4.2尼莫地平样品处理直接沉淀法：分别以甲醇和乙腈做蛋白沉淀剂，提取回收率均在90%以上，但动物预试验未能测出血药浓度，表明本品血药浓度低，样品需采用液—液提取浓缩的方法处理。
4.3有机溶剂在药物水溶液中的提取回收率结果表明：提取前应先用2mol·L-1碳酸钠溶液碱化，碱化后的回收率大于80%。
4.4沉淀试剂的选择根据提取液挥发的难易及空白干扰情况，沉淀蛋白可使药物释放出来，选择甲醇沉淀，环乙烷提取，提取液离心易分层，两者对组织匀浆和粪便匀浆提取率均高且相当，由于内标在此提取条件下回收率不稳定，测定方法选用外标法。
【参考文献】
[1]卫生部药品审评办公室，药物制剂人体生物利用度试验指导原则[S]．中国临床药理学杂志，1992，8（3）：189～190．新晨