视网膜组织病理结构改变范文

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摘要：观察牛磺酸对N甲基D天冬氨酸(NmethylDaspartate，NMDA)兴奋毒性引起的大鼠视网膜组织结构及超微结构损伤的保护作用。方法在大鼠玻璃体腔内每眼注射5μl4mmol/LNMDA造成视网膜兴奋毒性损伤模型，20只成年雄性SD大鼠随机分为4组：正常对照组；NMDA组；NMDA+牛磺酸干预组(腹腔注射25mg/kg牛磺酸)；磷酸盐缓冲液(PBS)对照组。玻璃体注射后第4d，测量视网膜总厚度及内层厚度并用透射电镜观察视网膜超微结构。结果NMDA使大鼠视网膜总厚度尤其是视网膜内层厚度变薄(P＜0001)，超微结构显示内核层及节细胞层神经元发生变性改变，25mg/kg牛磺酸干预可有效保护视网膜组织结构，削弱NMDA引起的视网膜超微结构损伤。结论牛磺酸在体内可有效保护NMDA引起的视网膜组织结构及超微结构损伤。

关键词：牛磺酸N甲基D天冬氨酸兴奋毒性视网膜超微结构

兴奋性氨基酸(EAA)引起的兴奋毒性是糖尿病视网膜病变〔1〕、青光眼、视网膜变性等疾病的视网膜神经元损伤及死亡的主要机制之一。体内研究表明，视网膜的兴奋毒性主要由N甲基D天冬氨酸(NmethylDaspartate,NMDA)受体介导〔2〕。牛磺酸(Taurine)是视网膜含量最丰富的游离氨基酸，近年来发现，牛磺酸可以保护培养的小脑颗粒细胞对抗兴奋毒性损伤〔3〕。本实验通过在大鼠玻璃体内注射NMDA制备视网膜兴奋毒性损伤模型，观察牛磺酸对NMDA诱导的视网膜组织结构及超微结构损伤的保护作用。

1、材料与方法

1、1实验动物及视网膜NMDA兴奋毒性损伤动物模型的建立成年雄性SpragueDawley大鼠20只，体质量200～250g(第三军医大学野战外科研究所实验动物中心)，实验动物质量合格证号：SCXK(军)2002008。大鼠腹腔注射速眠新注射液01ml/100g(长春军需大学兽医研究所)麻醉，5%托品酰胺散瞳，1%利多卡因进行角膜表面麻醉，用微量注射器从颞上方巩膜距角膜缘外3mm处进针，见针尖到达玻璃体中后部后，缓慢注入5μl4mmol/L的NMDA〔2〕。洁霉素滴眼预防感染。眼瞎大鼠弃去。

1、2实验分组20只大鼠按随机数字表法分为4组：(1)正常对照组；(2)NMDA组；(3)NMDA+牛磺酸干预组；(4)磷酸盐缓冲液(PBS)对照组；每组5只大鼠。正常对照组不进行任何处理；NMDA组为上述模型组；牛磺酸干预组于眼内注射NMDA前1h及其后每天腹腔注射牛磺酸(25mg/kg〔4〕)，共注射3d；PBS对照组于玻璃体内注射5μl01mol/LPBS。玻璃体注射后第4d观察指标变化。NMDA、牛磺酸(美国Sigma公司)，用无菌01mol/LPBS稀释。

1、3视网膜组织病理学观察及视网膜厚度测量腹腔注射2ml/100g03%戊巴比妥钠处死大鼠，迅速摘取右眼，去除前节、晶状体及玻璃体，将眼杯用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，经视乳头切片(5μm)，苏木精伊红(HE)染色，观察视网膜组织结构并照相，LEICAQWIN图像分析软件于距视乳头中心15mm处双侧测量视网膜全层及视见网膜内层(包括内核层、内网状层、节细胞层和神经纤维层)厚度，每只眼球取6张切片，每组5只大鼠结果求平均值。

14视网膜超微结构观察按前法处死大鼠，摘取左眼，将眼杯迅速置于4℃预冷的3%戊二醛固定，常规1%钅我酸固定，系列丙酮脱水，环氧树脂浸透包埋，经光镜定位后行超薄切片，于TENCAI10PHILIPS透射电镜下观察视网膜各层细胞的超微结构。

15统计分析采用SPSS统计软件处理，组间比较用单因素方差分析。

2、结果

2、1视网膜组织病理结构改变及视网膜厚度测量

表1各组视网膜总厚度及视网膜内层厚度测量结果

HE染色及视网膜厚度测量结果显示，玻璃体内注射NMDA后第4d，与未注射眼视网膜相比，视网膜总厚度变薄(P＜0001)，尤以视网膜内层厚度变薄明显(P＜0001)，节细胞数有减少，而视网膜内、外段及外核层改变不明显。牛磺酸干预使视网膜总厚度(P=0017)及内网状层厚度(P=0001)较模型组增厚，节细胞的丢失减少。表明牛磺酸干预可有效保护NMDA兴奋毒性对视网膜组织病理结构改变。

2、2玻璃体注射NMDA及牛磺酸干预对视网膜超微结构的影响透射电镜观察发现，玻璃体注射NMDA后第4d，视网膜内核层细胞及节细胞超微结构发生改变。镜下可见，NMDA组：视细胞胞体无明显病变，色素上皮细胞及盘膜正常，内核层神经元线粒体中、重度肿胀，嵴消失甚至空泡样变，内质网严重扩张，节细胞部分轴突明显肿胀，视神经纤维明显肿胀甚至解体，整个内核层神经元及节细胞表现为变性改变。牛磺酸干预组：内核层细胞有轻度线粒体肿胀及内质网扩张，节细胞超微结构正常，仅部分节细胞见轻度线粒体肿胀和内质网扩张，视神经纤维层轴突肿胀不明显，牛磺酸组超微结构改变较NMDA组明显减轻。

3、讨论

目前认为EAA引起的兴奋毒性是糖尿病视网膜病变、青光眼、视网膜缺氧等的视网膜神经元死亡的主要机制之一。研究表明〔2〕，视网膜内层神经元的兴奋毒性损伤主要由对NMDA受体的过度刺激引起，NMDA受体的各亚单位在视网膜主要见于内网状层的突触后神经元，即无足细胞和节细胞〔5〕。Lam等〔6〕用玻璃体内注射NMDA的大鼠模型发现，注射18h后内核层和节细胞层出现大量细胞凋亡。腹腔注射NMDA受体拮抗剂-MK801能有效预防NMDA对视网膜细胞的损伤〔7〕。将NMDA受体拮抗剂用于预防视网膜兴奋毒性是一种值得探索的方向，但由于NMDA受体同时介导许多正常的生理功能，其拮抗剂用于人体可能对中枢神经系统产生多种副作用，使其临床应用受到限制〔8〕。牛磺酸是一种正常存在于人体多种组织的游离氨基酸，目前公认牛磺酸是一个调节及降低神经细胞内Ca2+水平的强有力因子〔9〕。有研究提示，牛磺酸可通过防止或降低谷氨酸诱导的胞内Ca2+水平的升高而保护培养的大脑神经元〔3〕。我们研究发现，牛横酸可保护大鼠糖尿病视网膜病变的组织结构及超微结构损伤〔10〕。本实验发现，牛磺酸在体内可拮抗NMDA兴奋毒性对视网膜组织结构及超微结构的损伤。由于目前未发现较高剂量的牛磺酸摄入对人体有负面影响，提示将其用于预防EAA兴奋毒性引起的视网膜神经元损伤可能有较好的临床应用前景。