细胞层面显微镜的运用范文

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1原子力显微镜简介

最初的AFM是在一个弹性悬臂上固定一个尖端极细的探针在样品表面扫描。探针针尖上的原子与样本表面的原子之间存在一定的斥力，扫描时针尖随样本表面的高低起伏变化，使悬臂随之上下起伏，用一束激光照到悬臂上，其上下起伏可由激光束的变化反射到接收装置中，经计算机处理后形成样品表面的三维形貌图。根据针尖与样本的接触情况，AFM有两种扫描模式：接触模式与轻敲模式，前者指针尖在扫描过程中始终与样品接触，后者则是利用悬臂的高频震动使针尖间断地与样品接触。AFM的成像原理使它具有其他显微技术所不具备的优点：1)分辨率高；2)观察的样品范围很广；3)制样简单；4)可在液态环境中观察；5)成像时间短，可得到物体表面的三维形貌图。在医学诊断中，AFM能够观察到细胞膜原子量级的变化，这对于疑难病例的进一步诊断与研究，可以起到很大的辅助作用，在人体的各个系统中，相关学科研究者先后应用原子力显微镜进行了大量的观察分析。

2原子力显微镜在医学中的应用

2.1心血管系统

早期，LalR对于心脏的缝隙连接，DomkeJ对单个心肌细胞的机械脉冲这些心肌细胞间的微细结构都进行了观察。Davies等，Miyazaki等较早利用AFM对兔腹主动脉内皮细胞的观察，在一个侧面反映了内皮细胞的相关特性。而Sato等[3]应用AFM测量静息培养及剪切应力作用下的牛主动脉内皮细胞的局部力学特征。近年来，Wildling等[4]应用AFM测量培养的人类对血管内皮细胞EA.hy926表面和醛固酮化的AFM针尖之间的剪切力和粘附性，得出结论是血管内皮细胞膜表面存在醛固酮受体。而Jacot等[5]的研究中关注了基板僵硬在心肌细胞成熟中的影响。发现，心外膜的弹性模量自胚胎期的(12±4)kPa到新生儿期的(39±7)kPa。这种变化从一定程度上说明了显著影响新生儿心肌发展的因素。

2.2消化系统

虽然扫描电镜和透射电镜可以显示完整的细胞骨架及孔的轮廓，但是AFM却可以对肝内皮细胞窦孔进行观察，AFM可显示窦孔为抬高的嵴，间接反映出管性细胞骨架[6]。Braet等[7]用AFM观察到肝脏的自然杀伤细胞(NK细胞)和CC531s大肠癌细胞在共同培养基中相互结合后，CC531s大肠癌细胞的数量减少，这为临床治疗提供了思路，可以尝试导入NK细胞来杀伤癌细胞。

2.3呼吸系统

在气体交换过程中，肺泡表面活性物质(TM)可以调节肺泡的表面张力，从而保持肺结构的稳定性。TM由40nm×40nm的正方形拉长的蛋白质脂蛋白组成，早在1999年Nag等[8]就应用AFM联合TEM对TM进行了研究。侯淑莲等利用AFM对产生了TM的特殊三维结构进行了观察。

2.4神经系统

Annalisa等较早的利用AFM比较了人的正常神经细胞和神经肿瘤细胞表面的形态结构，并观察到了神经元突起，Ohshiro等[9]将神经轴突和RBL间的信息传递在AFM上进行了成像。应用力学方面，使用弹性常数为0.03N/m的微悬臂，当谐振频率为30kHz时，对多种活细胞如大鼠海马神经元细胞、星形胶质细胞等进行了成像研究，在细胞培养液中可获得高分辨的活细胞表面形貌信息[10-11]。刘智良等[12]在实验中，利用AFM观察和测定到了红藻氨酸作用后海马神经元胞膜表面超微结构明显变化。刑仕歌等研究发现一定浓度的Ach可损伤神经细胞膜，降低细胞存活率，损伤程度有时间和剂量依赖性。陈勇等对培养的PC12神经元细胞从形态学方面探究，应用AFM可以观察到其凋亡小体的膜表面发生了明显的变化。对于不同来源的神经干细胞，周虎田等[13]应用原子力显微镜观测到细胞表面形貌结构的异同：更深入揭示了不同来源的神经干细胞增殖、分化差异的机制。Cecchi等[14]利用AFM在接触模式下，就人类SH-SY5Y神经母细胞瘤中ADDLs对膜脂质过量和胆固醇含量的依赖性进行了调查研究。

2.5血液系统

使用AFM对人外周血淋巴细胞活化48h内的形态学变化进行的研究[15]表明：淋巴细胞在受刺激后形貌发生明显变化，同时细胞表面超微结构也趋复杂，出现免疫突触。刘美莉等[16]利用AFM和SNOM分别进行了观察，发现淋巴细胞表面分布着凹凸不平的颗粒状结构，可以更深入的了解免疫信号的传递、淋巴细胞的活化、阐明免疫过程的作用机制。蔡小芳[17]通过AFM力曲线的分析发现正常淋巴细胞和Jurkat细胞的力学性能有着明显区别。说明原子力显微镜以其分子力谱的优势可能可以应用于临床区分正常细胞和肿瘤细胞。胡怡等[18]利用原子力显微镜从可视化的角度观察人血小板与Ⅰ型胶原膜相互作用后受激活化过程中的形态学变化。

2.6泌尿生殖系统

利用AFM观测膀胱癌病人BIU-87活细胞的超微结构，显示了单个癌细胞的动态变化，细胞间的连接，通过胞膜伸出的突触。之后又对人膀胱癌细胞株T24活细胞进行了动态成像观察。

2.7眼科

用AFM研究正常兔角膜内皮细胞，获得了内皮细胞表面及覆盖于表面的糖链图像，并将戊二醛固定标本的结晶与刚摘除的新鲜标本的结晶相比较，同时用唾液酸酐酶及透明质酸酶处理样品后还获取了糖链组成的信息。实验证明：透明质酸酶处理的标本较唾液酸酐酶处理标本细胞表面及形态变化较少，更接近于固定的未处理的内皮细胞真实形态。

2.8口腔科

AFM在牙科生物材料的研究中具有广泛的应用价值。Hegedus等[21]对牙釉质表面进行侵蚀方面的观察实验。Marshall[22]，Wennerberg等[23]用AFM成像观察了Carisolv处理龋齿前后表面的变化，肯定了Carisolv的治疗价值。Arzate等较早利用AFM观察比较了人的牙骨质癌细胞和造骨细胞不同的形貌特征；李鑫辉等将原子力显微技术引入到口腔肿瘤病理学的研究中。除了获得高分辨率的癌细胞内部超微结构成像之外，还对样品表面进行了局部操纵。

2.9肿瘤细胞的观察

应用AFM观察肿瘤细胞，利用所测得的形貌图和相图将观察到的肿瘤细胞和正常细胞进行比较，可以直观的获得细胞的异同，为探究肿瘤疾病的病因及发生机制开辟了新途径。早期，Ehrenhoefer等对MDCK细胞、WuHW等对L929细胞、Goldmann等对F9细胞、Rotsch等[24]对腺癌细胞的观察，发现各类细胞的细胞膜表面均有高度不等的“突起”和“凹陷”；不同种类的细胞“突起”和“凹陷”不同，表现出明显的差异。陈勇等[25]对培养的人胃癌SGC7901、人肝癌HepG2、人肺癌细胞AF2TC2A21、人乳腺癌MCF272R和人肺腺癌A549细胞经药物作用后，进行细胞膜表面超微结构的观察，对于相关肿瘤细胞的特性有了更直观的了解。近期，Kaul-Ghanekar等[26]发现相对与正常相临近的组织切片，SMAR1表达减低的人类乳腺癌组织切片的表面粗糙度增高。王希涛等[27]应用AFM观察了S100A8/A9处理后的人宫颈癌上皮细胞癌细胞系CasKi细胞，细胞形貌发生卷曲，皱缩，细胞膜下的骨架结构比较模糊，排列紊乱，网络状的结构遭到了破坏，细胞间连接和伪足减少。从而证实了S100A8/A9蛋白复合物对细胞骨架的影响是通过改变F-肌动蛋白的解聚和重排发生作用的。

3展望

AFM在医学应用中，制约因素主要有：首先，细胞纯度的提取，单细胞的获得。由于在各个器官组织中存在多种细胞，而且取得的玻片标本中，细胞厚度均匀不一，无法清楚的获得AFM扫描图像，甚至无法顺利进行扫描，而培养的细胞和原生的细胞存在很大差异。其次，普遍研究的是经过溶液固定的细胞和组织，以至于处理后的细胞活性大大降低，因此主要的研究热点转为利用AFM在生理条件下对新鲜组织和活性的细胞进行高分辨成像。但是，能够在生理条件下，使用AFM对活体生物样本进行高分辨成像的细胞种类还不多，成像质量也有待提高。所以，探索一个更适合的单细胞取材方法，开发在生理状态下对活性细胞的探测手段，扩展原子力显微镜的观察范围，将为AFM在各学科中的应用开辟更大的空间。