辣椒碱纳米乳粒径测定范文

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1仪器与试药

1.1仪器

JB??2型恒温磁力搅拌器（上海智光仪器仪表有限公司），十万分之一电子分析天平（BP211D，德国赛多利斯），F??4500Hitachi荧光分光光度计（日本日立公司），ZetasizerNanoZS90纳米粒度及Zeta电位分析仪（英国MalvernInstrumentsLtd），JEL??IOOCXⅡ透射电镜(日本)，ShimadzuLC??10A高效液相色谱仪（日本岛津公司），ShimadzuRF??10AXL荧光检测器（日本岛津公司）。

1.2试药

辣椒碱原料（贵州安顺生达生物科技开发公司，纯度≥97%，批号20030503），辣椒碱对照品（SIGMA公司，纯度≥97％，批号2069698），中链脂肪酸三甘油酯（MCT，德国SasolGermanyGmbH，iv级，批号061224），吐温80（上海申宇医药有限公司，药用级，批号080201），豆磷脂（上海金伴药业有限公司，药用级，批号021109），葡聚糖SephadexG??50（北京拜尔迪生物公司，批号17??0043??02），丙二醇（天津市富宇精细化工有限公司，批号071012），色谱甲醇（天津四友化学试剂厂），超纯水，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1纳米乳处方筛选

2.1.1纳米乳的制备称取适量的药物、油、乳化剂、助乳化剂，搅拌混匀，50℃水浴加热溶解，得均匀透明的溶液；在磁力搅拌下将此溶液逐滴加入60～65℃蒸馏水中乳化。

2.1.2油、表面活性剂种类分别以大豆油、MCT、油酸乙酯为油相，吐温80、泊洛沙姆F68、豆磷脂为乳化剂，考察外观及700nm透光率（此波长药物、辅料自身无吸收，透光率仅与乳滴大小成反比），初步筛选乳剂的组成，结果见表1。结果表明：乳化剂与油的质量比为4∶1时，乳化剂的乳化能力由强到弱排列是：吐温80＞泊洛沙姆F68＞豆磷脂，故选择吐温80为乳化剂；油相被乳化由强到弱排列是：油酸乙酯≈MCT＞大豆油，而MCT已被欧洲药典准许用于注射剂，且已有上市产品［12］436-439，故选择MCT为油相。

表1油相、表面活性剂种类对粒径的影响（略）

br1Effectofoilphaseandsurfactantsonparticlesize

2.1.3表面活性剂用量吐温80与MCT按不同质量比，分别以4∶1、3∶1、2.5∶1、2∶1、1∶1混合，按“2.1.1”项制备，考察外观及700nm透光率，结果见表2。结果表明：在MCT与丙二醇的量、制备工艺相同前提下，吐温80∶MCT≥2.5∶1时能形成微乳。因此，选择吐温80∶MCT=2.5∶1作为表面活性剂与油最低比例。

2.1.4复合乳化剂比例固定（吐温80+豆磷脂）∶MCT=2.5∶1，将吐温80与豆磷脂按不同质量比混合，考察方法同“2.1.3”项，结果见表3。结果表明：当吐温80∶豆磷脂≥2∶1时能形成微乳。为减少吐温80的用量，选择吐温80∶豆磷脂=2∶1为复合乳化剂比例。

2.1.5油浓度固定吐温80∶豆磷脂∶MCT=0.25∶0.125∶0.15，按“2.1.1”项制备，考察MCT不同浓度时的包封率。由表4可见，辣椒碱纳米乳包封率随MCT浓度的增大而相应提高，当MCT浓度上升至1.50%，包封率为85.22%，符合药典的相关规定（包封率＞80%）。

2.2纳米乳制备工艺优化

2.2.1乳化温度选择将药物、油、复合乳化剂、助乳化剂按处方量混匀，50℃水浴加热溶解，得均匀透明的溶液，在磁力搅拌下将此溶液分别逐滴加入60～65℃与常温（25℃）蒸馏水中乳化30min。辣椒碱纳米乳包封率结果见表5。结果表明：60～65℃乳化的包封率略高于常温乳化。为简化生产工艺，选择常温（25℃）乳化。

表2油与表面活性剂比例对粒径的影响（略）

br2Effectoftheproportionbetweenoilandsurfactantsonparticlesize

表3复合乳化剂比例对粒径的影响（略）

br3Effectoftheproportionofcompositeemulsifiersonparticlesize

表4油浓度对辣椒碱纳米乳包封率的影响（略）

br4Effectofoilconcentrationonentrapmentefficiencyofcapsaicinnanoemulsion

2.2.2油、水滴加顺序将药物、油、复合乳化剂、助乳化剂按“2.2.1”项制备均匀透明的溶液，在磁力搅拌下，分别将此溶液逐滴加入25℃蒸馏水中，以及将25℃蒸馏水一次倾入该溶液中乳化30min，包封率结果见表6。结果表明：油、水滴加顺序对包封率影响不大。考虑今后工业生产更简单，选择蒸馏水一次倾入油中乳化的方式。

表5温度对辣椒碱纳米乳包封率影响（略）

br5Effectoftemperatureonentrapmentefficiencyofcapsaicinnanoemulsion

表6制备工艺对辣椒碱纳米乳包封率影响（略）

br6Effectofpreparationtechnologyonentrapmentefficiencyofcapsaicinnanoemulsion

2.3辣椒碱纳米乳注射剂的制备

依据辣椒碱纳米乳处方设计与工艺研究结果，结合注射剂的制备工艺，拟定辣椒碱纳米乳注射剂制备工艺如下：按处方量称取辣椒碱、油、乳化剂、助乳化剂，50℃水浴加热溶解，得均匀透明的溶液；在磁力搅拌下，将常温蒸馏水（0.22μm滤过灭菌）倾入该溶液乳化30min，形成淡黄色、澄清透明的辣椒碱纳米乳。于洁净环境下，0.22μm微孔滤膜过滤辣椒碱纳米乳，将续滤液灌装在已灭菌的2mL、5mL安瓿中，拉封。将灌封好的辣椒碱纳米乳注射剂121℃、0.1MPa热压灭菌15min，即得。

2.4形态与粒径测定

2.4.1形态测定取适量辣椒碱纳米乳，滴在覆有支持膜的铜网上，静止10min后用滤纸片吸干，滴加1～3％磷钨酸溶液于铜网上负染5min，自然挥干，用透射电子显微镜观察并拍摄照片，结果见图1。结果表明:纳米乳剂中的乳滴呈类球形，粒径分布均匀。

图1辣椒碱纳米乳透射电镜照片(×50000)（略）

Figure1Transmissionelectronphotographofcapsaicinnanoemulsion(×50000)

2.4.2粒径大小与分布测定取辣椒碱纳米乳适量，采用动态光散射（dynamiclightscattering,DLS）原理的Nicomp380/ZLS激光粒度/动电位分析仪测定，其粒径与粒度分布见图2。结果表明：辣椒碱纳米乳的平均粒径6.16nm，多分散系数0.307，粒度分布均匀。

图2辣椒碱纳米乳粒径分布图（略）

Figure2Particlesizedistributionofcapsaicinnanoemulsion

2.5动电位测定

采用电泳光散射（electrophoreticlightscattering,ELS）法，取辣椒碱纳米乳适量，室温下置Nicomp380/ZLS激光粒度/动电位分析仪测定，动电位分布见图3。结果表明，所得辣椒碱纳米乳电位(ζ)平均值为－34.0mV。

2.6pH值测定

测定3批辣椒碱纳米乳的pH值，每批测定3次，取平均值。3批乳剂的pH值分别为5.45、5.43、5.45，符合静脉注射剂对pH值的要求。

图3辣椒碱纳米乳动电位分布图

Figure2Zetapotentialmicroscopedistributionofcapsaicinnanoemulsion

2.7辣椒碱纳米乳含量测定

2.7.1色谱条件与系统适应性试验色谱柱为DiamonsilC18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇?菜??擦姿幔ㄌ寤?比70∶30∶0.1）；荧光检测波长为λex=283nm,λem=310nm；流速为1.0mL?min-1；进样量为20μL。辣椒碱保留时间12.3min，理论塔板数4156，拖尾因子1.13，峰形对称，色谱图见图4A。

2.7.2样品溶液的制备精密称取0.10mg辣椒碱对照品，无水乙醇溶解并定容至10mL，取该液1.0mL，无水乙醇稀释至10mL，摇匀，制得1.0μg/mL辣椒碱对照液。精密量取0.004%辣椒碱纳米乳0.30mL（约相当于辣椒碱12μg），无水乙醇溶解并定容至10mL，超声混匀，制得1.2μg/mL辣椒碱供试液。精密量取不含辣椒碱的空白纳米乳0.30mL，同法制得阴性对照液。

2.7.3方法专属性考察分别量取对照液、供试液及阴性对照液20μL，按上述色谱条件测定，结果表明，空白基质无干扰，且供试液与对照液保留时间基本一致，见图4。

图43种样品溶液荧光??HPLC图（略）

Figure4Fluorescence??HPLCofthreesamples

2.7.4标准曲线绘制精密称取辣椒碱对照品0.20mg于10mL容量瓶中，无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得20μg/mL辣椒碱标准储备液。精密吸取该储备液0.1、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0mL置10mL容量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，摇匀，制得系列浓度对照液。分别进样20μL，按上述色谱条件测定，以对照液质量浓度（ρ）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，计算回归方程为：A=4×106ρ-224614，r=0.9997，结果表明辣椒碱在0.20～6.00μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。以信噪比（S/N）＝3计算，测得辣椒碱最低检测限为0.1ng。

2.7.5精密度试验取0.1μg/mL辣椒碱对照液，连续进样5次，测得平均峰面积为10012711，RSD为0.54%，表明仪器精密度良好。

2.7.6重现性试验按上述方法制备浓度为0.8、1.0、2.0、4.0、6.0μg/mL的辣椒碱供试液，各3份，以1.0μg/mL辣椒碱对照液的峰面积定量，结果各浓度辣椒碱含量平均值为91.10%、94.94%、91.03%、91.01%、90.04%；RSD（n=3）为0.37%、0.85%、0.25%、0.42%、1.7%，表明本方法重现性良好。

2.7.7稳定性试验取供试液适量，分别于室温放置0、2、4、6、8、12、24h后按色谱条件测定，测得峰面积日内RSD为0.32%（n=7），表明供试液在24h内稳定。每天测1次，连续测5d，峰面积日间RSD为1.5%（n=5）。

2.7.8回收率试验精密量取0.50mL空白纳米乳15份，分3组，置10mL容量瓶中，分别加入20μg/mL辣椒碱标准储备液0.40、0.50、1.00mL，各5份，无水乙醇定容，超声混匀，0.45μm滤过，精密吸取续滤液20μL按上述色谱条件测定，外标法计算回收率。结果高、中、低浓度平均回收率分别为100.14%、102.56%、107.25%，RSD值分别为1.30%、0.83%、0.58%（n＝5），见表7。

2.7.9含量测定精密量取0.004%辣椒碱纳米乳0.50mL，无水乙醇溶解并定容至10mL，超声混匀，得辣椒碱供试液；另精密称取辣椒碱对照品适量，无水乙醇配成2.0μg/mL辣椒碱对照液。分别吸取辣椒碱供试液、对照液20μL，按上述色谱条件测定，外标法计算含量。结果3个批号辣椒碱含量分别为94.50%、94.55%和94.10%。

表7辣椒碱纳米乳回收率（略）

br7Recoveryofcapsaicinnanoemulsion

2.8辣椒碱纳米乳包封率测定

包封率测定方法参照文献［13］:量取0.004%辣椒碱纳米乳0.3mL滴到葡聚糖凝胶柱中心，2000r/min离心5min，洗脱液用无水乙醇溶解并定容至10mL，超声混匀，按“2.7.1”项色谱条件测定，将峰面积代入标准曲线计算药物浓度。根据式1-1计算辣椒碱纳米乳的包封率。

包封率＝（ρ包封/ρ总药）×100%（1-1）

式中ρ总药表示辣椒碱总质量浓度，ρ包封表示纳米乳中被包封辣椒碱质量浓度。测得3批辣椒碱纳米乳的包封率分别为85.83%、84.50%、85.34%，RSD为0.79%。见表8。

表8辣椒碱纳米乳包封率（略）

br8Entrapmentefficiencyofcapsaicinnanoemulsion

3讨论

3.1影响乳滴粒径因素

3.1.1油、表面活性剂种类油、表面活性剂种类是影响乳滴粒径的重要因素。根据纳米乳形成机理，当表面活性剂的亲水亲油平衡值（HLB）与油所需HLB值相当时，形成纳米乳较稳定［14］。当油、表面活性剂浓度不变，分别以大豆油、油酸乙酯、MCT为油相，形成乳滴粒径由小到大排列：吐温80＜泊洛沙姆F68＜豆磷脂。可见，乳化剂乳化能力由强到弱排列：吐温80＞泊洛沙姆F68＞豆磷脂。同时，表3结果也表明，乳滴粒径随吐温80增加、豆磷脂减少而逐渐减小，说明吐温80乳化能力较强。制备O/W型乳剂，所需乳化剂的HLB值在8～16范围内，吐温80的HLB值为15.0；而豆磷脂仅3.0，脂溶性过强，在水相体系中分散性较差，难以在油水两相中很好的分配；相反，泊洛沙姆F68的HLB值为29.0［12］516-519，亲水性强，不能在油水界面大量吸附，也难以形成牢固的界面膜，故乳化能力均较差。

油的种类同样影响微乳的形成。如表1所示，吐温80作乳化剂，油酸乙酯或MCT为油相时均能形成透明微乳，而大豆油不能，这可能与大豆油为长链植物油，较难乳化有关。依据文献［15～18］报道，油相分子的大小以及碳链的长短影响微乳的形成：油相分子体积越小，对药物的溶解能力越强；碳氢链越短的油越能嵌入表面活性剂中形成界面膜，所得微乳相图区域越大。反之，碳氢链过长的油则不易形成微乳。因此，油酸乙酯、MCT较大豆油易乳化。

3.1.2表面活性剂用量当油、表面活性剂种类固定时，表面活性剂用量显著影响乳滴粒径的大小。如表2所示，吐温80∶MCT的质量比由1∶1增大到4∶1时，透光率由0.5%增大到99.6%，可见乳滴粒径随表面活性剂用量增大而减小。文献［19］也说明，纳米乳中乳化剂的用量为油量的20%～30%，而普通乳中乳化剂多低于油量的10%。这是因为纳米乳乳滴小界面积大，表面能高，需要浓度更高的乳化剂才能有效降低表面能，形成纳米乳。但考虑到毒性，在形成纳米乳前提下表面活性剂的用量应尽可能少。新晨

3.2影响包封率因素

除了油的种类影响乳滴粒径以外，油的浓度是影响纳米乳包封率的关键因素。当MCT由0.15g增大到1.50g时，包封率由20.07%提高到85.22%。这是因为当辣椒碱浓度不变时，增大油的量，乳化剂、助乳化剂按比例增加，药质比随之提高，使更多药物溶解在油、乳化剂、助乳化剂组成的均相中，形成均匀透明的溶液；遇水乳化后药物被包裹的比例随之提高。此外，表5、表6说明乳化温度与油、水滴加顺序对辣椒碱纳米乳包封率的影响不大。

【参考文献】

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