药理学天珠散抗血管性痴呆研究范文

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一、方法

1.天珠散样品的红外光谱鉴别傅里叶变换红外光谱法（Fouriertransforminfraredspectroscopy，FTIR）是一种常用的结构分析技术，可宏观整体鉴定复杂体系，具有无损、快速、简便等特点，是鉴定未知混合物化学组成和化学结构的有效方法之一，逐渐被应用于中药的真伪优劣鉴别[11-12]。将天麻、延龄草、天珠散超微粉碎。超微粉分别与溴化钾混合，研磨均匀，压片后进行FTIR光谱测定，获得一维红外光谱图。

2.海马组织全基因组芯片检测

2.1慢性低灌注型VD模型制备及给药参考文献[13]方法，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35g/kg）进行麻醉，仰卧位固定，颈正中备皮消毒，切开1.5-2.0cm切口，分离双侧颈总动脉，用手术线将双侧颈总动脉永久结扎（commoncarotidartery，CCA），完成后，肌肉恢复原位，缝合。同条件正常饲养60d（说明：本实验室已建立了稳定的慢性低灌注型VD大鼠模型复制和评价的方法，因研究目的不同，略去神经行为学评价部分）。造模结束后，将实验大鼠随机分为模型组、给药组。造模24h后，各组动物灌胃给药，空白组和模型组给予蒸馏水，给药组给予天珠散超微粉625mg/kg（按体质量法计算有效剂量），连续给药60d。

2.2全基因组芯片检测

2.2.1样品制备：各组分别随机选取3只大鼠，取海马组织液氮保存。以Trizol法抽提组织总RNA，并纯化RNA，以琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。由纯化的总RNA合成双链cDNA，纯化，片段化cDNA，荧光标记。

2.2.2杂交和洗涤：将片段化的cDNA和其他对照试剂混合，制备成杂交液。将杂交液注入芯片中，在杂交炉中杂交16h。从杂交炉中取出芯片，加入洗脱液和染色液，在全自动洗脱染色工作站中完成洗脱和染色。

2.2.3荧光扫描：芯片结果采用扫描仪进行扫描，读取信号。

2.2.4数据预处理与分析：将信号值进行预处理，包括数据过滤，将信号值进行以2为底取对数转换，数据归一化。采用SBCAnalysisSystem系统进行一维方差分析（OnewayANOVA），计算模型组和给药组差异表达的显著性强度。计算模型组与给药组差异表达信号强度的比值，比值＞2为表达显著上调基因，比值＜0.5为表达显著下调基因。

3.基于中药语法系统（directedTCMgrammarsystems，dTGS）的靶点关系网络构建实体语法系统（entitygrammarsystems，EGS）是针对生物复杂系统建模所建立的一种形式语法系统[14]。由于其灵活的特点，EGS已经应用于化工过程中调控流图模型的构建[15]，中药作用机理的阐释[16]。EGS构建的详细描述见参考文献[15]，在此仅作简要叙述。EGS用G表示，由5个基本元素组成，G=（VN,VT,F,P,S），其中VN∪VT=V，VN表示非末端字符集，VT表示末端字符集，VN∩VT=Φ，F表示基本元素之间的结构关系，P代表由已知实体产生新实体的推理规则，S表示系统初始状态，即推理的起点。

3.1dTGS原理dTGS和EGS具有相同的结构：集合V包括不同的节点类型（差异表达基因、蛋白质、疾病相关靶点等），集合F包含网络中不同的节点关系类型，集合P包含的规则用于节点间关系的推断，描述如下。①V=V1∪V2∪V3∪V4，其中，V1为差异基因表达的蛋白质集合，V2为疾病相关靶点集合，V3为背景网络中的其它蛋白质集合，V4为背景网络中的非蛋白质分子集合。link（X,Y,Z,W）定义为节点X（如蛋白质）作用于节点Y（如蛋白质），作用方式为Z（正向或负向），作用距离为W，若W为1，则表明节点X作用于节点Y只经过了一步反应。在本研究中in（X）标记为差异基因表达的蛋白质，out（Y）标记为疾病相关蛋白质，totalnet（X,Y,Z,W）即表示为以X为起点，Y为终点的多条通路，作用方式为Z，作用距离为W，每一条通路中的W值可以为不同的整数值。minnet（X,Y,Z,W）中的W表示为以X为起点，Y为终点的所有信号通路中作用距离最短的一条通路的步长。P1表示以in（A）为起点推导出的link（A,B,X,Y），标记的link（A,B,X,Y）定义为totalnet（A,B,X,Y）。P2∪P3∪P4∪P5为规则集，通过这4个规则推导网络中标记的蛋白质对下游蛋白质的最终作用方式和距离。规则P2表示如果A对B的作用是正向，B对C的方向是正向，则A对C的作用方式是正向的。同时，如果A作用于B的需要D步反应，B作用于C经过E步反应，则A作用于C的距离为D＋E。同样的定义规则P3，P4和P5。如果起始蛋白对疾病靶点间的通路有多条时可以用规则P6辨识出作用距离最短的一条通路。在规则P6中，如果totalnet（A,B,C,X）中的B为疾病相关靶点（即终点），那么#min{D:totalnet（A,B,_,D）}=X表示从A到B的最短距离为X。在网络构建过程中，由起点推导到最后的疾病靶点可能需要使用多次上述规则。④S=S1∪S2，其中，S1表示在背景网络中用于推理的具有link（X,Y,Z,W）结构的实体集合。S2为标记的蛋白质，表示为in（X）和out（Y）。

3.2数据来源差异基因表达的蛋白质来源于GeneCards数据库。VD疾病相关靶点蛋白数据来源于SciClips数据库。以生物学反应及信号通路数据建立的背景网络来源于Reactome数据库。将得到的结果minnet（A,B,C,X），利用软件Cytoscape实现网络的可视化。

二、结果

1.天珠散样品的红外光谱鉴别天珠散中的天麻收录在《中华人民共和国药典》中并有质量控制标准[17]，但是延龄草尚未收录在《中华人民共和国药典》中，缺少相应标准。天珠散在土家族民间为打粉服用，且有效成分不明确，无法采用定量数据进行质量控制，因此，文章采用FTIR对其进行定性鉴别。天珠散及其组方中延玲草、天麻的红外光谱图见图1，3种样品的红外光谱均具有很高的相似度，相似系数都在0.96以上。在4000-1300cm-1波数范围的官能团区有几个明显的特征峰，分别为3390、2929、1736、1655、1515、1415和1371cm-1。文章选择了10个主要的吸收峰进行对比，不同样品各个吸收峰的详细对照表见表1。在选择的10个主要吸收峰的对比中可以明显地看到，峰的吻合性很好，最大波数差异为5，根据谱图中特征峰的变化规律，可以鉴别各单味药对复方配伍的整体贡献，该研究方法能够准确快速鉴别复方及各组方药物，在缺乏质量控制标准的情况下实现对天珠散进行质量控制的目的。

2.海马组织全基因组芯片检测给药组与模型组的全基因组芯片检测结果比较，得到差异表达基因229条，其中上调基因（>2）219条，下调基因（<0.5）10条，说明天珠散是通过调控上述基因发挥抗VD的作用。

3.差异基因表达蛋白作用于VD靶点的生物网络以Reactome数据库中的生物学反应及信号通路数据为背景网络构建差异基因表达蛋白作用于VD靶点的生物网络，见图2。图中较大的圆形节点代表疾病相关靶点，较小的圆形节点代表差异表达基因，六边形节点代表差异基因表达的蛋白质及通路中涉及的蛋白质，平行四边形节点代表复合物，方形节点代表小分子，三角形代表不同的生物反应。其中带有三角形箭头的边代表正向调节作用，T形箭头的边代表负向调节作用，无向边代表作用方向不确定。该网络可从分子水平整体展示差异基因表达蛋白的抗VD作用机制。由图2可知，差异基因凝血因子V（coagulationfoctorV，F5）、Cyp11b3、Cyp2d6、Ins1和Ins2表达的蛋白经过多步生化反应影响VD相关靶点：内皮型一氧化氮合酶（NOS3）、胰岛素（INS）和血清载脂蛋白A1（APOA1）。差异基因Aoc3的表达蛋白-血管黏附蛋白-1（vascularadhesionprotein1，VAP-1）直接为VD相关的靶点。由于纳入网络中的差异基因要求在十步反应内就要作用于疾病靶点，而且有些基因表达的蛋白与背景网络中其它生物分子间的联系还没有相关研究，甚至部分基因的表达蛋白目前还不明确，导致网络中涉及的差异基因相对较少，虽然基因表达发生变化但并未体现在网络中。相信随着对基因、基因表达蛋白和疾病相关关系研究的深入，基于EGS构建的网络将能够更清晰完整地阐释天珠散抗VD的作用机制。仅从该网络我们仍可得出天珠散影响多个基因的表达，通过多条通路作用于多个疾病相关靶点起到抗VD的作用。

图2中6个差异表达基因通过多条生物途径作用于4个VD靶点，表明天珠散是通过多途径、多靶点发挥抗VD的作用，同时也说明生物网络的稳健性、冗余性等特征。我们可以提取出每一条子网络来清晰展示差异表达基因和VD相关靶点间的生物网络。限于篇幅，文章仅从图2提取出两条子网络作为示例，图3为F5作用于NOS3的通路，图4为Cyp11b3作用于INS的通路。F5基因编码生成的辅因子（FA5）是凝血级联反应中一个重要的因子，为促凝性非酶辅因子。单链F5在凝血酶作用下通过修饰生成具有促凝辅助活性的双聚体FVa，在钙离子存在的条件下，FVa和FXa在磷脂膜表面上形成FVa-FXa复合物，增强FVa使凝血酶原转变成凝血酶的能力。目前，发现有4个蛋白酶激活受体（PAR），其中3个为凝血酶受体，人体内几乎所有细胞都有不同类型的PARS存在与表达，其生理功能非常广泛，包括诱发凝血反应、促进细胞分裂与增殖、释放炎性介质等。激活PAR能刺激胞浆磷脂酶、蛋白激酶、丝裂原蛋白活化激酶等的各种反应，促进细胞生长。在天珠散的影响下，给药组F5基因表达量为模型组的0.4452，导致下游的反应减少，凝血作用降低，同时产生的能量降低，促使脂肪酸β氧化加速。VanOM等的研究证实，凝血因子升高与AD和VD的发病危险增加有关，其中与VaD的相关性更强，有效控制这一因素可预防认知障碍。

Paralemmin-1（PALM）结合辅酶A生成PALM-CoA，PALM在大脑中表达量最高，它影响质膜动力学，细胞形成，调节伪足、神经元突触的形成、树突棘的成熟，最终影响神经系统的发育和适应性。同时，异常的NOS3基因表达使其产生的NO与超氧自由基反应，生成毒性作用更强的氧自由基，破坏神经元脂质蛋白及核酸，还能通过对神经元内线粒体呼吸功能的抑制，损伤呼吸链，最终造成神经细胞死亡。目前研究发现，慢性脑缺血导致脑组织损伤的机制主要有细胞凋亡、免疫反应、氧化应激及缺血后神经递质的改变等，目前的观点也认为，NO几乎参与了所有的损伤途径。NOS3主要存在于血管内皮细胞，可抑制血管内皮表面血小板和白细胞的黏附、聚集，抑制血管平滑肌细胞增生，产生肌肉舒张、血管扩张和血流量增加的作用，对脑卒中、高血压病引起的血管内皮功能异常具有治疗作用。综上，F5基因主要通过降低凝血作用，同时改变神经元间的接触点及突触，影响作为神经递质和信使分子的NO，最后在氧化应激、免疫反应、细胞凋亡及缺血后神经递质改变方面发挥抗VD的药理作用。Cyp11b3基因生成的蛋白Cyp11b3属于细胞色素P450家族，是一类以血红素为辅基的B族细胞色素。目前，超过50%的药物代谢经由细胞色素P450氧化，在药物代谢和解毒方面有重要意义。细胞色素P450与NOS一样，都是以硫醇盐结合血红素为活性中心催化氧原子转移的氧化还原酶。Cyp11b3作为一种末端加氧酶，将传递所得电子转移给TPN，TPN为氧化型辅酶2，经过氧化还原反应参与生成2-氧戊二酸盐（2OG）和谷氨酸（Glu），Glu的释放依赖于Ca2+，在Ca2+存在时，动作电位达到神经突触前膜末梢后，突触囊泡与突触结合，通过胞吐作用将Glu释放到突触间隙，作为兴奋性神经递质参与信息传递。在脑组织缺血早期，由于脑缺血过度激活Glu受体，导致细胞内Ca2+超载、自由基数目增加、细胞内的线粒体损伤，出现神经元和胶质细胞的快速死亡。胰岛β细胞分泌INS是由胰岛素分泌颗粒局部Ca2+浓度的迅速升高而触发的，不同时相下的胰岛素分泌或胰岛素的不同阶段可能由不同来源的Ca2+触发或增强，两者相互协调，在胰岛素分泌中起重要作用[33]。Hassing等[34]通过对702例80岁以上老年VD患者的研究发现：2型糖尿病患者患VD的可能性是非糖尿病患者的3倍。该信号通路也展示了糖尿病作为VD的重要致病因素的部分机制。综上，Cyp11b3表达的蛋白质通过影响神经递质Glu和第二信使Ca2+发挥抗VD的作用。

三、讨论

本研究共得到差异表达基因229条，其中上调基因（>2）219条，下调基因（<0.5）10条；通过对大鼠海马组织全基因组芯片检测结果中上调、下调基因及差异基因表达蛋白作用于VD靶点的生物网络分析，得出天珠散主要通过3条途径发挥抗VD的作用：①调节与认知功能有关的突触损伤；②通过调节血管内皮凝血因子、血管黏附蛋白及NOS3，影响缺血性脑血管内皮细胞的生长及其炎性反应；③影响中枢神经系统中起神经递质和第二信使作用的Glu、NO和Ca2+。结果表明天珠散是通过调控多个基因的表达，影响多条生物途径、作用于多个靶点发挥抗VD的作用。中药方剂作用于生物体，导致体内基因表达发生变化，差异基因表达蛋白将通过一系列的生化反应影响到疾病相关靶点。本研究从中药方剂和治疗对象这两个整体出发，并且沿中药方剂-差异基因-差异基因表达蛋白-疾病相关靶点这个完整的生物学过程，系统研究天珠散抗VD的分子机制。虽然基因表达发生变化并不一定说明蛋白表达产生变化，但是存在着很大的可能性，而且生物通路中上游的微小变化将对下游产生极大影响。综上，相比于传统研究方法，本文采用系统药理学的思想和方法，能从分子水平上更快速、更系统地阐明中药方剂作用机制，对于中药方剂功效预测、合理利用以及疾病生物标志物的选择具有一定的指导作用。关于本思路合理性的验证还需要进一步实验的支持。

本研究的结果是根据现有数据库中收录的数据进行的推断，部分基因的表达蛋白还有待补充，所以结果仍具有一定的局限性。为了找到与抗VD相关性较大的作用机制，本文生物反应步数限制在10步以内，所以，纳入网络的差异基因及疾病靶点数量相对较少。相信随着对基因表达蛋白、人类生物学反应和信号通路的进一步研究，该方法利用的数据将更加完善，所得结果也将更加准确和完整。由于生物系统具有动态演变及个体差异的特点，我们仍需要建立能够量化的数学模型来模拟复杂系统的大量功能各异的分子在非线性相互作用下产生的功能和行为。因而阐明和定量预测中药作用机制仍需要实验和计算研究的整合，这也将是我们今后研究的重要方向。

作者：张百霞 宋阔魁 李彦文 张燕玲 李志勇 王耘 单位：北京中医药大学中药学院 中央民族大学少数民族传统医学研究院 中国中医科学院中医药信息研究所