氯离子通道药理学特征分析范文

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氯离子转运通常被认为是阴离子转运的代表，其转运形式及转运通道蛋白的状态对细胞的活性而言显得尤为重要。深受研究者的关注[1]，细胞体积和内环境稳态的调节对氯离子转运起着决定性作用。其内环境条件包含了诸多形式的调节，如：电生理调节、膜上离子及物质转运、胞内体积及酸碱性（pH值）调节等。从功能上看，Cl-Ionchannel(氯离子通道)在很大程度上影响了细胞的功能，如：细胞的免疫应答、细胞增殖与分化都有氯离子通道的参与，现阶段不少研究发现，细胞的凋亡（Apoptosis）与氯离子通道存在很多相互依存关系。氯离子膜通道的功能与特性直接影响细胞的活性状态，更进一步推进我们对疾病的生理及病理发生发展的全过程的了解。很多膜上蛋白通道参与细胞的电压门控等功能活动。研究表明,人类骨骼肌ClC家族区域对阴离子选择性传导通道结构有较大贡献[2]，所有的氯通道蛋白的ClC家族成员在相应的阴离子通道上都包含一个相对保守的模序GKxGPxxH.[3]Cl-的跨膜转运是非常重要的生理功能之一，在生物体内，Cl-的数量相对较多，广泛存在于原、真核生物细胞及卵母细胞上的一种阴离子通道上，近几年来，相关的通道基因表达及分布功能研究都在一定程度上取得了重大突破性进展。其中在卵母细胞中，组氨酸残基37是野生型M2离子通道起始激活的主要因素之一[4]，在细胞膜上，阴离子通道是允许阴离子顺电化学梯度被动扩散的蛋白通道，由于Cl-在生物体内数量较多，分布广泛，其通透性作用最佳。大量的生物物理学研究发现，在很多蛋白通道中，都存在具有特征性的门控现象[3]，就通道本身而言，Cl-通道主要是电压门控通道，主要有细胞肿胀依赖性、信号分子偶联性、相关离子依赖性、胞内多种蛋白激酶磷酸化依赖性以及ATP的水解反应相偶联等诸多特性。

从电生理角度看，Cl-通道平衡电位与静息电位相似，其功能与K+通道相类似，抑制细胞的兴奋性，同时促进去极化后复极，进而维持细胞静息膜电位。在胞膜及胞内细胞器上的Cl-通道的功能主要表现为电转运和物质转运，尤其在神经和肌肉细胞的细胞膜上，Cl-电流是参与兴奋性调节的重要离子流。在一定程度上影响细胞的容积，执行物质转运的任务，调节并维持着细胞的体积。就Cl-通道蛋白自身结构而言，暂可分为：电压依赖性Cl-通道(ClC家族)、囊性纤维转膜电导调节体型（CFTR）、Cl-通道及配体门控Cl-通道。此通道是动态大分子复合物，其细胞质的附属蛋白参与分子间作用调节并为其通道的功能可塑性提供分子基础[5]。

1电压依赖性Cl-通道（ClC家族）广泛存在于原核、真核生物细胞，在哺乳动物体内主要在细胞的质膜及胞内各细胞器的膜上，其分子结构相对复杂，目前已发现9个亚基，包括ClCO-7、ClC-Ka、ClC-Kb,其跨膜结构比较复杂，有较好的功能研究价值大多数ClC通道都有电压依赖门控效应。Cl-通道受阴离子和pH值调节的影响。同时受到蛋白激酶(PKA、PKC)或胞内信使的调控作用，研究发现，很多生物疾病发生与Cl-通道蛋白基因序列变化有关，其中的几种特殊的遗传疾病都与ClC通道基因发生突变有密切关联，另外，ClC-K通道的β亚基的突变也在很大程度上影响人类部分疾病的发生。在哺乳动物体内，其疾病发生的部位较复杂，主要分布于骨骼肌、小肠、肾脏、心脏及肝脏等器官上。心脏的发病因素比较特殊，目前也有部分研究认为该病是由HCN4离子通道作为领头突变体而导致[6]。Cl-通道电流特征主要表现为CFTR依赖Cl-通道电流或cAMP依赖的Cl-通道,其特性可以有以下表现：a.普遍外向整流性；b.非时间依赖性；c.对β-受体阻断剂敏感；d.对离子通透性有一定的顺序。

2囊性纤维转膜电导调节体型（CFTR）Cl-通道家族CFTR主要发挥跨膜离子转运功能，上皮细胞缺乏Cl-转运功能、组织缺水、盐分泌和重吸收的平衡失调是囊性纤维变性（CF）致命性遗传性疾病的主要的细胞微环境病理表现。多种研究表明，CFTR在这种遗传性疾病中起着决定性作用，其中CF基因已经被发现，研究也证实了CFTR是cAMP-依赖性的Cl-通道。其开放需要足够量的AMP，存在能量及物质转换过程,当胞内、胞外氯离子浓度相当时，CFTR的I-V呈线性关系，但是在胞内与胞外Cl-浓度相差较大时，其I-V线性关系不是很明显。在心肌细胞上，CFTR通道电流表现较为突出。CFTR有两种类型：PKA激活的Cl-通道（Icl,PKA）和PKC激活的Cl-通道（Icl,PKC）,有些综合肽也行使着Cl-选择性通道功能[7]，其中它参与细胞活性及其他离子通道的调节作用。其磷酸化后结构域起着重要的功能导向作用。基于电生理考虑，离子通道大多是涉及到离子相位改变的电化学体系。其通道介质间的离子的转移对离子通道阻抗的变化发挥重要的作用[8]。

3甘氨酸和γ-氨基酸受体（GABA）相关的配体门控Cl-通道聚焦中枢神经系统，作为神经介质的GABA和甘氨酸通过控制Cl-的内流使神经元超级化而发挥抑制性调节作用。神经介质主要使Cl-内流，神经细胞超级化而抑制其活性，成年动物中枢神经系统中表现突出。在中枢神经系统发育早期，GABA和甘氨酸使神经细胞发生较强的去极化并使Ca2+内流进而促发神经递质释放。随着神经细胞的发育，细胞内Cl-浓度逐渐下降，再是阳离子反转体KCC2上调，使GABA和甘氨酸介导的电流也从兴奋向抑制转化。就通道结构而言，GABA和甘氨酸及烟碱同属配体门控离子通道超家族（LGLC）体系，常规通道蛋白上含有5个亚基，每个亚基约有200个氨基酸组成的巨大胞外氨基酸结构域，4个跨膜结构域和一个较为短大的胞外羧基末梢。从分子层面看，氨基酸末端结构域含有一个保守序列，被称为：Cys环，由不同长度的胞内环相连接而成，其三维晶体结构尚未明朗，需进一步探究。目前随着微尺度技术研究的进展，结构和功能研究已趋向成熟，应用纳米微管及微孔技术研究离子通道相关蛋白生物分子的转运已成为现实[9]。

4Ca2+激活的Cl-通道Ca2+激活的Cl-通道在细胞正常的生理活动中起着非同寻常的作用，包含了上皮细胞电解质和水的分泌、神经和心肌细胞兴奋性调节、感觉换能及血管紧张长度的调节等作用。其中离子通道电流-电压的关联具有离子浓度的依赖性[10]，部分Cl-通道的激活还依赖于细胞外Ca2+，其中ClC-K1通道为典型表现。和K+通道一样，原核生物中的有丰富的ClC家族基因，为通道蛋白表达和结构分析提供良好的环境[11]。相反，有种特殊的Cl-通道能被细胞外Ca2+所阻断，譬如：蟾蜍卵母细胞上就有一种特殊的Cl-通道。遗传学研究已经结合通道研究分别通过动物体内有害物质的检测进一步研究部分生物分子功能特征和信号通路[12]，就电生理而论，瞬时外向K+电流主要包括两种成分:一种为4-AP(4-氨基吡啶)敏感的K+电流（Ito1），另外一种被称为Ito2，它对4-AP不敏感，可被阴离子转运抑制剂阻滞。其电流即为Ca2+激活的Cl-电流（Id,ca）,它不被4-AP所抑制。当然，若细胞缺乏或根本就没有K+，而细胞内K+由Ca2+所代替，该离子流依然存在，所以它不是K+电流，而是由Ca2+所激活。当细胞内或细胞外Cl-浓度降低时，能明显减弱该离子流，与Cl-密切相关，其激活曲线可以随细胞外Cl-的浓度发生变化，当细胞外无Cl-时，该电流消失。随着膜片钳技术应用，离子通道对待试离子的选择性已被较好的掌握，当通道中多种离子被K+或Cl-替代后，其翻转电位仅以6mV或更小的幅度变化，提示此通道对待试离子的选择性较低[13]。从翻转电位中可以发现，Cl-通道选择性不是很完美，其中KCl转膜电流的变化也需要一定的电压来调制[14]。

5肿胀激活的Cl-通道（Icl,swel）在肾小球及胃肠上皮细胞上广泛分布有肿胀激活的Cl-通道参与调节细胞体积。通常此通道通过激活Na+/H+和Cl-/Hco3-交换使细胞内外离子浓度达到平衡从而调节维持细胞体积稳定。而且通过不同的跨膜电压模拟装置可以容易判断膜通道两侧的离子是否转运和其转运方向[15]，Icl,swell通道的激活通常依赖于细胞内的ATP,存在明显的能量消耗，其通道本身具有外向整流特性，没有明显的时间依赖性激活。当ATP浓度较低时，Mg2+能阻断Icl,swell通道，胞内高ATP浓度改变Icl,swell通道最大激活位点并降低激活速率。ClC家族中Cl-阴离子通道同时存在于真核生物和原核生物细胞内[16]，了解Cl-通道数量通常选用最佳定量化学计算法进行推断,也有些离子通道模型成功建立，其中BD模型比较深入地阐述了Cl-和K+通道电活动及离子走向[17]。ClC-7作为家族成员之一，是阴离子通道和转运体，在溶酶体破骨细胞类似物中起着决定性作用，其丢失直接导致骨质缺乏病变[18]，目前情况下，膜蛋白生物物理学研究的核心问题还是离子通道门控机制[19]，可以深入研究。ClC-3的PKC的磷酸化的位点为N端Serine51（丝氨酸51）,通常用alanine（丙氨酸）代替Serine(S51A)可消除PKC的抑制作用，也同样消除8-Br-cAMP的抑制作用，尤其在动物心房肌中表现明显。在心肌细胞和血管内皮细胞上，因细胞暴露于低渗液引起肿胀可诱发Icl,swell或容积依赖的Cl-通道（Icl,vol）电流,该通道为非时间和电压依赖性的，同时也不依赖于细胞内Ca2+，电流不能被一些阻断剂阻断。很可能是通过细胞骨架成分或质膜牵张而引起，其电流对渗透压非常敏感。除此之外，蛋白激酶C(PKC)激活的Cl-电流在部分动物心室肌细胞中被发现，在细胞内用弗波脂能诱导出时间依赖性且不对称Cl-电流，同时有研究发现此中电流可以被芳香族单羧酸阻断。其中，弗波脂作为PKC惯用激动剂。最为突出的ATP激活的Cl-通道电流（Icl,ATP）和内向电流Cl-电流（Icl,ir）存在于动物心肌等诸细胞中，细胞外的ATP可以通过三种作用机制作用于心肌细胞：通过嘌呤相关受体增加K+电导和抑制β肾上腺素能激动的腺甘酸环化酶；通过嘌呤能P2受体可以增加Ca2+电流，在G蛋白参与下并刺激磷酸肌醇的降解产生IP3和DG,并最后激活PKC；通过嘌呤能P2受体也可以刺激Cl-/HCO3-交换体而导致细胞内酸化，同时激活非选择性的阳离子电流。当ATP与其对应的嘌呤受体结合时，即可产生相关电流，此电流具有外向整流性，但无时间依赖性，其中对肾上腺素能受体激动剂较为敏感。大鼠心室肌细胞相关研究表明，ADP和ATP能激活Icl,ATP,而AMP和腺苷酸无特殊作用，因而可以推断这种作用是通过嘌呤能P2受体。在通道研究过程中，为了更进一步证实推断的正确性，通常借助模型进行模拟研究，譬如，在与记忆退行性病变的脑疾病相关蛋白研究中，淀粉样β蛋白（A-β）离子通道结构模型已有较完整阐述[20]。

6P64基因家族表达的胞内Cl-通道（ClC）Landry等人在牛肾细胞上分离出ClC通道。其分子量具有64KD,被命名为P64表达的Cl-通道

7Cl-通道的药理和生理意义a.不同细胞中作用于Cl-通道的工具药不尽相同。Cl-通道无明显的特异性阻断剂，其非阻断剂较多，且被广泛应用，不同的Cl-电流可能对不同的阻断剂较为敏感，因而我们针对不同的细胞需要选相应的阻断剂。b.Cl-通道的生理功能：Cl-通常作为背景电流，由于它在静息电位时活动，在一些特定类型的细胞中通常决定该类型细胞静息电位的作用，尤其在非可兴奋细胞上一般没有Ik1电流，根据细胞内的Cl-的活动度来计算，其翻转电位在生理条件下为-65～-45Mv,正于这个电位时，为外向电流，负于这个电位时多为内向电流。就Cl-通道在细胞上分布的情况而言，其功能特点可分为一下几个方面：

（一）细胞膜上Cl-通道主要功能特点：（1）维持正常细胞容积及内环境稳定。（2）有较强的跨膜转运功能，Cl-通道是多数上皮细胞离子和水分跨膜转运所必须的，细胞膜上Cl-通道表达的极性强弱和继发激活Cl-重吸收机制共同决定转运的方向。（3）大多存在兴奋性调节机制：Cl-通道能够调节细胞膜兴奋性，尤其在骨骼肌细胞，对电压门控Cl-通道ClC-1调节兴奋性作用尤为突出。

（二）细胞内Cl-通道功能特点：正常情况下，阴离子或转运体对阴性基团的生物合成起着关键作用。在胞内，Cl-通道可以调节相关细胞器的体积。在溶酶体和高尔基体中表现较为明显。

（三）细胞膜上Cl-通道在心肌细胞中的主要生理作用：Cl-电流在心肌细胞上电活动通常不是很明显，而在一些特殊情况下产生的作用较为显著。

（四）cAMP依赖性的氯电流（Icl,cAMP）的生理作用。在正常生理状态下，氯电位（Ecl）与实际膜电位相比可以为正，也可以为负，当膜电位比Ecl为负时，Icl，cAMP的激活产生内向电流，使静息电位去极化，相反为外向电流，可加逐复极化过程。

（五）氯离子电流的生理功能。维持静息电位。Cl-通道在等渗透状态下已有部分激活，在此背景下，Cl-电流在维持静息电位中起一定作用。如果进一步激活通道，可以使膜电位向Cl-平衡电位移动。故而引起膜电位超极化，影响相关系统的电化学梯度。

8讨论：研究Cl-通道药理学价值离子通道的蛋白结构和其门控特性是构成离子通道药理学特点的重要基础。Cl-通道研究为研制特异性的通道激动剂或阻断剂打下基础。由于Cl-电流的缩短动作电位时程的作用，其拮抗剂可以延长动作电位时程而具有抗心律失常作用，这可能成为新的抗心律失常药物的来源。至今为止，对于阴离子通道来说，实现很好地特异性激活或阻断通道并不容易。大多数离子通道激活剂或阻断剂都不是高特异性的，所以使用这些激动剂或阻断剂必然会带来很多负作用，由此可见，通过离子通道学研究筛选特异性较强的抑制剂或激动剂是药理学的发展的重要方向。同时从分子诊断及治疗的角度看，通过通道蛋白相关作用位点及通道受体和药物配体间的相互作用等方面的深入了解，可以帮助我们找到有效治疗相关疾病的靶标药物，这些都值得我们跟踪研究。