初探药证对应的机制范文

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类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种慢性自身免疫性疾病，存在多基因、多通路、多途径的分子功能网络相互作用的复杂病理过程［1-2］。RA属于中医的“痹证”范畴，其证候多样，但寒、热证候属性特征最为明显，在临床辨证论治中的价值也最大［3］。辨证施治、“药-证对应”是中医的基本治则，虽然已有大量RA中医治疗的临床和实验报道，但RA“药-证对应”的分子机制尚不清楚。随着基因组学、蛋白组学、系统生物学的发展，网络药理学(NetworkPharmacology)应运而生，它在网络生物学与多向药理学的基础上提出的药物设计的新思想［4-5］。研究中药多靶点的药理作用机制及复杂疾病网络，最有可能揭示辨证施治的分子基础。本研究基于网络药理学，应用文本挖掘和生物信息学技术，以RA热证为切入点，通过构建、分析RA热证的分子生物网络以及对证中药的药物靶标网络，寻找RA热证“药-证对应”的靶标网络和生物学通路，初步探索RA热证“药-证对应”的分子生物学基础。

1方法

1．1基于RA热证的对证中药定向文本挖掘文本挖掘分为文本数据收集、处理、结构化分析、可视化以及评价5个步骤［6］。首先，登录中国生物医学文献数据库，检索关键词“类风湿关节炎OR类风湿性关节炎”。文献14435篇(检索日期:2011年9月15日)。将收集来的数据，以ANSI编码格式保存。利用文本提取工具，对下载的非结构化的TXT文本数据进行信息提取，保存成格式化的、便于数据库(Access)和大型数据库(MicrosoftSQLServer，SQL)处理的格式。通过关键词对构造算法［7］进行数据清洗工作。然后结合专业知识进行解析，继续按关键词对构造算法进行噪音清洗，直到噪音降到满意为止。然后，结合中医证候要素特点进行定向文本挖掘，在RA数据集内，按照“热”为关键词对文献的主题词进行检索，将数据集定义为“热”子集。然后，针对这个数据子集，分别执行后续的计算［7］。经过计算，可以得到中医治疗RA热证要素的中药用药规律。用可视化软件Cytoscape2．8．2进行可视化处理，并以网络图的形式展现出来。

1．2PubChem数据库搜索药物靶蛋白将定向文本挖掘出的对证治疗RA热证的中药分别输入PubChem数据库［8］检索，找到每种有效成分的人类活性靶蛋白。

1．3基因芯片分析典型RA热证与正常人外周血CD4+T细胞差异基因中日友好医院门诊病人中，随机选取符合纳入标准的早期RA女性患者，RA证候问卷表采集患者各项证候信息，参照相应标准进行寒、热证候判断，筛选出符合纳入标准的RA女性热证患者12名。同时按照排除标准选取中国中医科学院12名健康志愿者(年龄在18岁至70岁之间)作为对照组。采集RA热证患者及健康人空腹静脉血，分离纯化得到CD4+T淋巴细胞，用于基因表达谱芯片分析。比较RA热证与正常人差异基因，选取1．4倍以上的上调及下调的差异基因分析，具体分析步骤见本课题组前期研究报道［9］。

1．4分别构建RA热证对证中药靶标网络及RA热证生物学网络并进行对应分析利用IPA(IngenuityPathwayAnalysis)生物分析软件，在线提交定向文本挖掘出的基于RA热证对证药物的靶蛋白列表及RA热证与正常人差异基因列表。分别构建基于RA热证对证中药靶标蛋白的相互作用网络以及基于RA热证与正常人比较差异基因的相互作用网络。利用软件中的Network、CanonicalPathway、Functions及Comparison等功能模块进行分析，获得药物靶标网络功能及重要生物学通路。同时，比较药物靶标网络和RA热证分子网络，寻找和分析二者的生物学通路的异同。

2结果

2．1RA热证定向文本挖掘结果通过定向文本挖掘，筛选出治疗RA热证的4个常用中药:黄柏、知母、苍术及牛膝，将其作为研究的对象，见图1。

2．2RA热证对证中药靶蛋白及靶标网络通过检索PubChem数据库，分别找到RA热证的对证中药:黄柏、知母、苍术及牛膝4味中药共有靶蛋白123个(略)。通过IPA软件将这些靶蛋白构建RA热证的对证中药靶蛋白的相互作用网络，见图2A所示。经IPA分析，该网络排名前5位的生物学功能见表1。

2．3RA热证与正常人差异基因生物学网络及功能RA热证与正常人CD4+T淋巴细胞的差异基因中，上调基因15个，下调基因6个，详见本课题组前期研究报道［9］。基于上述差异基因和IPA构建的蛋白质相互作用网络见图2B。经IPA分析，该网络主要生物学功能见表2。

2．4RA热证差异基因及其对证中药靶蛋白的共同生物学通路在IPA系统的Comparison功能中，比较RA热证差异基因及其对证中药靶蛋白的共同生物学通路，发现在细胞免疫反应相关的信号通路中，二者都参与了共同的生物学通路:GM-CSF信号通路，CTLA4信号通路，T细胞受体信号通路及辅助T细胞中的CD28信号通路，如图3～4所示。在图4中，我们可以看到，这4条生物学通路中，RA热证差异基因及其对证中药靶蛋白都有参与，但作用的靶点并不尽相同。在GM-CSF信号通路中(图4，A)，RA热证与正常人比较，BCL2A1(Bfl-1)基因表达上调，而RA热证对证药靶点为GM-CSF信号通路中的AKT和Bcl-xL，这些分子最终共同干预细胞的存活及增殖。在细胞毒性的T淋巴细胞中CTLA4信号通路(图4，B)、T细胞受体信号通路(图4，C)及辅助T细胞中的CD28信号通路(图4，D)中，RA热证与正常人比较，上调了通路中的CTLA4基因，而对证中药靶点为AKT和NF-κB，都通过信号通路的网络影响到整个通路的生物学功能。

3讨论

文本挖掘技术能以线性和非线性方式解析数据，且能进行高层次的知识整合，又善于处理模糊和非量化数据［10］。大量的中医药临床报道积累了丰富的文本数据，为文本挖掘提供了充分的数据条件［7，11］。蛋白质相互作用网络(Protein-proteinInteractionNetwork)是研究生物功能或病理变化分子基础的新途径和新方法，也是目前国际上生物信息学研究的热点之一［12，13］。发现并建立与疾病相关的分子作用网络，对于认识复杂疾病至关重要，也是现代生物医学研究所面临的重大挑战［14］。网络药理学基本思路是理解疾病“表型-基因-靶点-药物”相互作用网络特征，通过网络分析，观察药物对疾病网络的干预与影响，寻找可能的组合药物靶标，预测最优化的组合药物［15］。

基于网络药理学关键技术研究，对于发现新药、预测药效及药理机制既是方法学创新，又具有重要的社会、经济效益［16］。RA属于中医中药的优势病种，“方-证对应”、“药-证对应”是中医药治疗的主流方向，研究中药网络药理学相关的关键技术和方法有望直观而深入地解释中医辨证论治的物质基础。PubChem数据库是由美国国立卫生研究院(NIH)建立的关于小分子生物活性的公共数据库［17］。通过其中丰富的物质、化合物和生物活性信息，以及数据库自身对这些信息进行整合分析的功能，检索治疗RA热证的中药，可以找到黄柏、知母、苍术、牛膝共123个，作为我们构建热证对证中药靶标网络的分子基础。IPA8．7生物分析软件［18］能够分析、整合、理解来自于基因表达等系统生物学、组学等的实验数据;能够搜索到有关基因、蛋白质、化学品和药物的信息，并能建立起实验系统的交互模型。在本研究中，我们除了利用IPA平台建立了RA热证生物学网络和热证对证中药靶标网络，同时利用IPA软件中ComparisonAnalysis分析功能对RA热证对证中药靶标网络与RA热证与正常人差异基因的分子网络进行比较分析，发现二者网络的异同点，以及二者生物学通路的异同点，进而寻找“药-证对应”的生物学基础。本研究结果显示，RA热证差异基因及其对证中药靶蛋白的共同生物学通路，都参与了细胞免疫反应相关的4条共同的生物学通路:GM-CSF信号通路，细胞毒性的T淋巴细胞中CTLA4信号通路，T细胞受体信号通路及辅助T细胞中的CD28信号通路。这4条信号通路都是参与体内细胞免疫反应及炎症反应等生命活动的重要生物学通路，在类风湿性关节炎的发生发展中起着关键的作用［19-21］。其中，一些通路的重要靶点，已经被研究者甚至美国FDA列为治疗RA的靶标，如GM-CSF［21］，CTLA4［22］。RA热证的疾病状态和对证中药的干预靶点，都能作用在相同的细胞信号转导通路，干预通路中的相同或不同的关键分子，进而影响整个通路的生物学功能。这也许就是对证中药治疗RA热证“药-证对应”的分子生物学机制之一，但还需要进一步实验验证。

目前网络药理学刚刚起步，其研究手段、计算方法及应用软件还处在探索阶段［23］。基于大量数据库和算法构建的分子网络及药物靶标网络，具有一定的预测性，还需要进一步实证实验的验证。但无疑，网络药理学为探索中医“药-证对应”及辩证施治的生物学基础开辟了一条高通量的途径，并为开发基于证候的优化药物组合、临床用药及新药研发提供了新思路、新方法。