胡黄连苦苷吸收动力学探究范文

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Picroliv为印度胡黄连活性成分胡黄连苦苷Ⅰ(picrosideⅠ，P－Ⅰ)、胡黄连苷制成的标准化制剂。对四氯化碳、硫代乙酰胺、单响尾蛇毒蛋白、土霉素及半乳糖胺等物质引起的肝损伤具有明显的保护作用，其中P－Ⅰ既可以对抗补体介导的肝细胞毒，又可对抗四氯化碳引导的肝细胞毒性［1］。本实验采用大鼠在体肠吸收模型，建立了HPLC法测定肠循环液中P－Ⅰ的经时浓度，对其在大鼠各肠段的吸收动力学特征进行初步研究，为其提供生物药剂学依据。

1试验材料

1．1药品与试剂

胡黄连苦苷Ⅰ(含量97.96%，本实验室提取分离制得，经光谱及核磁共振图谱鉴定结构);乌拉坦(中国上海曹阳第二中学化工厂);苯酚红(天津市新精细化工开发中心);甲醇(色谱纯，美国Dikma公司);其余试剂均为分析纯。

1．2实验仪器

LC－2010AHT型高效液相色谱仪(岛津公司);Class－VP6．0工作站(岛津公司);SartoriusBT25S电子天平(德国Sartorius公司);HJ－6A型数显恒温磁力搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);

HL－3恒流泵(上海精科实业有限公司);pH计(梅特勒－托利多仪器上海有限公司);722型spectrum可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。

1．3实验动物

清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量(200±20)g，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供(许可证号:SCXK(黑)2008004)。

2实验方法

2．1Krebs－Ringers肠循环灌流液的配制NaCl(6.75g/L)，KCl(0.31g/L)，CaCl2(0.37g/L)，NaH2PO4(0.22g/L)，MgSO4·7H2O(0.29g/L)，NaHCO3(1.83g/L)，Glucose(2.2g/L)，上述物质溶解在双蒸水中，调溶液pH值为7.4。

2．2肠循环灌流液中酚红的含量测定

2．2．1专属性考察

取肠循环灌流液0.5mL，加4.5mLNaOH(0.2mol/L)，以不加酚红的灌流液为空白，使用756型可见分光光度计，分别于200nm～700nm波长范围内进行扫描，酚红在558nm处有最大吸收，P－Ⅰ的最大吸收波长为282nm，表明酚红与P－Ⅰ不产生干扰。见图1。

图1肠循环灌流液光谱扫描图

2．2．2酚红标准曲线的制备

精密称定酚红6.25mg，用空白循环灌流液定容至25mL，分别取0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0mL定容至25mL，使酚红的终浓度为5、10、20、40、60、80μg/mL，取上述不同浓度的酚红溶液各0.5mL，加入4.5mLNaOH(0.2mol/L)溶液显色，立即于558nm处测定吸光度，以吸光度A与酚红浓度C(μg/mL)进行回归，得酚红测定的线性标准曲线为:A=0.0175C+0.0422，相关系数r=0.9993。

2．3肠循环灌流液中P－Ⅰ的含量测定

2．3．1色谱条件

色谱柱:DiamonsilC18(5μm，250mm×4.6mm);偶联DikmaEasyGuardIIC18保护柱;流动相:甲醇:水(45∶55);检测波长:282nm;流速:1.0mL/min;进样量:20μL;柱温:35℃;灵敏度:0．2AUFS。

2．3．2P－Ⅰ标准曲线的制备

精密称定P－Ⅰ2.52mg，用经过肠循环2h的K氏液定容至25mL，按倍数稀释成0.504、5.04、25.2、50.4、75.6、100.8μg/mL一系列浓度的标准溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，在上述条件下进样20μL，所得峰面积与浓度进行线性回归，得到P－Ⅰ标准曲线方程y=22213x－12576，相关系数r=0.9996。

2．3．3P－Ⅰ在空白K氏液中的稳定性考察分别取P－Ⅰ适量，用空白灌流液稀释至不同浓度，置37℃水浴中，并不断搅拌，分别于不同时间点取样，测定峰面积，根据标准曲线方程计算浓度，考察其在空白灌流液中的稳定性，表明对照品溶液在配制后3h内测定是稳定的。结果见表1。

2．4大鼠在体肠循环灌流实验

选取健康合格Wistar大鼠，实验前禁食不禁水12h，实验时10%乌拉坦10mL/kg腹腔注射麻醉，仰卧，固定于小动物手术台上，沿腹中线打开腹腔，结扎胆总管。分别选取十二指肠(距离胃的幽门1.5cm处开始15cm)，空肠(距离胃的幽门25cm处开始15cm)、回肠部位(距离盲肠上行长15cm)作为肠循环灌流部位。在选定肠段两端剪开小口，分别插入软管，扎紧，连接蠕动泵，使“肠段－软管－泵”形成一个闭合回路。开启恒流蠕动泵，用空白的Krebs－Ringers灌流液(不加酚红和测试药物)清洗肠腔至流出液清澈无脏物，泵入空气排净管中液体，然后泵入药液(37℃水浴并搅拌)，灌流速度为2mL/min，循环10min后从储液灌中取样3ml开始计时定为0点，以后每30min取肠循环灌流液，按照“2．2项及2．3项”，测定酚红和P－Ⅰ浓度，分析药物的吸收情况。

3实验结果

根据胡黄连苦苷Ⅰ肠循环灌流十二指肠、空肠、回肠的实验数值，计算剩余药量，见表2。剩余药量对数值与取样时间进行回归，得到线性方程，该方程斜率的绝对值即为吸收速率常数Ka(h－1)［2］，各方程及相关系数见表3。

由表3可以看出，P－Ⅰ在大鼠小肠吸收速率大小顺序为:空肠＞十二指肠＞回肠，对数据进行方差齐性检验及两两组间t检验，结果十二指肠、空肠、回肠的吸收速率均无显著性差异，表明P－Ⅰ在大鼠小肠中并无特异的吸收部位;根据以剩余药量的对数对取样时间进行线性回归方程中的相关系数r均大于0.9，表明药物浓度在肠道各部位的下降与循环时问呈线性关系，提示P－Ⅰ在大鼠小肠中吸收属于动力学为一级吸收。胡黄连苦苷Ⅰ大鼠肠吸收动力学的相关参数见表4。

根据文献报道［3］，大鼠表观渗透系数Papp＜0.03×10－4cm/s和＞0.2×10－4cm/s时，分别表示药物难以吸收和易于吸收，由表4可以看出，P－Ⅰ在十二指肠、空肠、回肠中的Papp分别为4.97×10－7cm/s，6.29×10－7cm/s，3.24×10－7cm/s，提示P－Ⅰ在肠道中难以被吸收。

4讨论

小肠是口服制剂的主要部位，研究表明，鼠小肠吸收模型与人类小肠吸收模型相似，用大鼠小肠吸收模型所得的数据能够有效应用于人类小肠的预测［4］。

本文采用单向灌流对P－Ⅰ的肠吸收进行了研究，肠段的灌流方法基于灌流前后肠腔内药物浓度的变化，由于小肠不仅吸收药物，同时也吸收或分泌水分导致灌流液的体积变化，本实验通过测定苯酚红的浓度进行校正。

P－Ⅰ在结构上属于环烯醚萜糖苷类化合物，性质不稳定，但其确有保肝利胆的药理作用。实验显示其几乎不被吸收，这就提示我们P－Ⅰ起效的可能不是原型药物，而可能是其在肠道中的代谢产物，具体其在体内的代谢行为还有待于进一步研究。