多糖方法范文

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1多糖的发展历史及其发展方向

多糖是由多个单糖基及糖苷键相连接而成的高聚物，一般是20个以上的单糖聚合而成，广泛存在于动物细胞膜，高等植物和微生物的细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一，同维持生命活动密切相关。蛋白质、核酸和多糖最重要的三种生物大分子，由于多糖的结构难以控制比蛋白质和核酸复杂得多，再加上人们早期只把多糖看作细胞结构成分和食物来源，使得人们对多糖的研究成为“生物化学中最后一个前言”。如100多年前，德国著名科学家就开始了糖类的研究。目前，以多糖结构、功能和药用价值为核心的糖工程被认为是继蛋白质工程、基因工程后生物化学和分子生物学领域中最后一个巨大的科学前沿。

目前，世界各国政府对多糖的生物学研究给予高度重视。1986年美国能源部资助佐治亚大学创建了复合糖研究中心，建立复合糖数据库。牛津大学Dwek教授在1988年提出糖生物学这个名词，这标志着糖生物学这一新的分支学科的诞生。日本于1989年创办了《糖科学与糖工程动态》杂志，出版了专著《糖工程学》。同年日本政府科学技术厅提出“糖工程基础与应用研究推进战略”。1990年E-选凝素的发现将糖生物学推向了生命科学的前沿。欧盟于1994-1998年发起“欧洲糖类研究开发网络”计划。糖生物学的时代正在加速来临，甚至有人预计，如同20世纪，蛋白质、肤类、氨基酸与核酸时代一样，21世纪应当是多糖生命科学的时代。

糖类的研究工作和蛋白质、核酸的研究工作相比，在我国还是一个薄弱的环节。我国在多糖方面的研究始于20世纪70年代，但近年来发展迅速，在全国第一次糖的生化学术会议后，《糖复合物的生化研究技术》出版，标志着我国在糖化学方面的研究工作已经有了一个较好的开端网。1996年我国将“糖生物学”列为国家重点课题。研究的对象包括植物类、动物、真菌类、细菌、地衣等；研究范围涉及多糖的分离纯化、理化性质、结构分析、免疫学、药理学以及临床应用等，其中对免疫提高作用机理的研究已经深入到分子、受体水平；研究的方法涉及化学、物理、生物学、医药学等诸多领域。我国地大物博，糖类资源也很丰富，而且有些真菌多糖还对生物体具有独特的生理作用，可以作为药用资源。

今后一个时期内，多糖的研究有以下几个趋势：从单味中药多糖的研究向中药复方多糖体系的研究发展；从单一免疫系统作用的研究向神经内分泌免疫网络作用的研究发展；从药品向食品、从治疗向保健发展。经过半个多世纪的发展，活性多糖的研究取得了重大进展。建立了一系列活性多糖的提取、纯化方法、生物活性测试方法、结构分析方法，发现了许多具有重要生理活性的多糖，研究的广度和深度在不断发展。随着多糖化学和糖生物学的深入研究，活性多糖将会进入一个新时代，将为人类的健康和安全提供更为有力的帮助。

2多糖的研究方法

2.1多糖的来源

多糖来源十分丰富，广泛存在于动物、植物、微生物（细菌和真菌）和海藻中（如植物的种子、茎和叶，动物粘液，昆虫及甲壳动物的壳真菌，细菌的胞内外等），从动植物器官组织、菌类及微生物发酵产物中可得到不同种类的多糖。按其来源可分为高等植物多糖、动物多糖、微生物多糖、藻类多糖。其中研究较早且最多的是从细菌中得到的各种荚膜多糖，它在医学上主要用于疫苗。1984年，苏联人在荷兰召开的第十二次国际碳水化合物讨论会上报道了用合成特定结构的荚膜多糖作疫苗，引起与会者的极大兴趣，此后有关真菌多糖的研究逐渐深入和广泛，如酵母菌多糖、食用菌多糖，特别是食用菌多糖的研究，取得了很大进展，其中以香菇多糖研究的较为深入。1969年，日本人千原首次报道从香菇中分离出一种抗肿瘤多糖，轰动了整个医学、药学界，之后掀起一股从食用或药用真菌中寻找抗肿瘤成分的热潮。另外，植物多糖的开发也倍受人们的青睐，由于我国是中药的起源之地，而糖类是中药材中普遍存在的成分，在对各种中药材的化学成分研究的过程中，人们都少不了对其中多糖的关注。植物多糖研究得比较深入的是稻草多糖、麦秸多糖、竹多糖、刺五茄多糖。海藻多糖虽然研究得不多，但其前途也是很光明的。到目前为止，已有300多种多糖化合物从天然产物中被分离出来。

2.2多糖的提取、分离纯化

2.2.1多糖的提取

多糖是极性大分子化合物，常用的提取方法有：热水浸提法、稀碱浸提法、酸浸提法和酶法。前三种为化学方法，酶法为生物方法。稀酸提取时，时间宜短、温度不宜超过50℃。一般植物多糖提取多采取热水浸提法。在提取多糖之前，首先要根据多糖的存在方式及提取部位的不同，决定在提取之前是否作预处理。动物多糖和微生物的细胞内多糖的组织细胞多有脂质包围，一般需先加入醇或醚进行回流脱脂，释放多糖，然后依多糖性质（如酸碱性、胞内或胞壁多糖）再将脱脂后的残渣采用以水为主体的溶剂（冷水、热水、稀盐或稀碱水、或热的稀盐或稀碱水）等溶液提取。溶剂性质、浸提温度、时间等均影响提取效果。现在，提取多糖还多采用酶法，常用的酶有纤维素酶、果胶酶、蛋白酶及其复合酶。

2.2.2多糖的分离

采用以上方法提取的多糖中常含有无机盐、大分子蛋白质、木质素、色素及醇不溶的小分子有机物等杂质，必须分别除去，将这些杂质除去的过程，一般称为多糖的分离。工业化生产中一般采取透析法、离子交换、凝胶过滤或超滤法除去这些杂质。对于大分子杂质，可用酶法、乙醇、丙酮溶剂沉淀法或络合物法除去。

脱蛋白质.

由于原料组成中均含有一定量的蛋白质，因此在多糖的提取工艺中，脱除蛋白质是分离多糖的重要步骤。常用的方法有：Sevag法，三氟三氯乙烷法，三氯乙酸法，酶法或酶法与Sevag法结合，等电点沉淀法。

Sevag法，利用蛋白质在氯仿中变性的特点，用氯仿：戊醇=5：1或4：1的二元溶剂体系按1：5加入到多糖提取液中，混合物经剧烈振摇后离心，蛋白质与氯仿-戊醇生成凝胶物而分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此法条件温和，但是效率不高，一般要脱除5次左右方可除尽蛋白质。酶法或酶法与Seveg法结合，用蛋白酶将蛋白质水解，再通过透析、凝胶过滤或超滤除去，是目前认为较好的脱蛋白质的方法。

三氟三氯乙烷法，将三氟三氯乙烷按1：1的比例加到多糖提取液中，在低温下搅拌约10min，离心得上层水层，水层继续用上述方法处理几次即得。此法效率高，但因溶剂沸点低，易挥发，不能大量使用。

三氯乙酸法，利用三氯乙酸沉淀蛋白质的原理，用3%-30%三氯乙酸，在低温下搅拌加入到多糖提取液中，直至溶液不再继续混浊为止离心弃沉淀，即可达到脱蛋白的目的。存在于溶液中的三氯乙酸经中和后，通过透析或超滤等方法除去。此法较为剧烈，会破坏含呋喃糖残基的多糖但效率高，操作简单，植物多糖多采用此法。

等电点沉淀法，逐步调节粗糖溶液pH至酸性（PH=2-5），可以有效除去大部分酸性蛋白质。其优点是适合于工业化生产，为防止在酸性条件下某些基团或糖普键被破坏，宜在低温下进行。

脱色

对于植物多糖可能会含有酚类化合物而颜色较深，而从动物和微生物等中提取的多糖也会带有不同深浅的颜色，对多糖进行脱色处理可使多糖的应用范围更加广泛。常用的脱色方法有：离子交换法、氧化法、技术络合物法、吸附法（纤维素、硅藻土、活性炭等）。一般情况下，可以用活性炭处理脱色，但活性炭会吸附多糖，造成多糖损失。DEAE-纤维素是目前最常用的脱色方法，通过离子交换柱不仅达到脱色目的，而且可以进行多糖的分离。H2O2作为一种氧化脱色剂，浓度不宜过高且在低温下进行，否则会引起多糖的降解。

2.2.3多糖的纯化

上述经过脱蛋白、脱色和去除小分子杂质的提取液是含多种组分的多糖混合物，即是多分散性的。其不均一性表现在化学组成、聚合度、分子形状等的不同。要得到单一的多糖组分，还需要进行纯化。通常采取的纯化方法有以下几种。

（l）分级沉淀法

利用不同分子量的多糖在不同浓度低级醇或低级酮中的溶解性不同的原理，逐步提高溶液中醇或酮的浓度，使不同组分的多糖依分子量由大至小的顺序分级沉淀可达到纯化的目的。

（2）季铵盐沉淀法

根据长链季铵盐能与酸性多糖形成不溶性多糖化合物的特性，以分离酸性和中性多糖常用的季铵盐是十六烷基三甲基嗅化钱（CTAB）及其碱（CTA-OH）和十六烷基吡啶（CPC）。实验时应严格控制多糖混合物的pH值小于9且无硼砂存在，否则中性多糖也会沉淀出来。通常CTAB或CPC水溶液的浓度为1%-10%（W/V），在搅拌下滴加于0.1-1%（W/V）的多糖溶液中，这时酸性多糖即能从中性多糖中沉淀出来。根据形成的沉淀能溶于不同的盐溶液、酸溶液和有机溶剂中的性质，使多糖游离出来。

（3）离子交换层析法

利用不同多糖分子电荷密度不同，而与离子交换剂中的离子或某些基团发生电性结合。其亲和力随多糖结构与电离性质而异，一般随着分子中酸性基团的增加而增强，线状分子、分子量较大的多糖亲和力较强，支链多糖较直链多糖更易吸收。常用的离子交换剂有树脂类、纤维素类和葡聚糖类。阴离子交换柱层析法适用于各种酸性、中性多糖和糖胺聚糖的分离纯化。在pH6.0时，酸性多糖能吸附于交换介质上，中性多糖不能吸附，然后用pH相同但离子强度不同的缓冲溶液将酸性强弱不同的酸性多糖分别洗脱下来，但如果柱子为碱性，则中性多糖也能吸附。但中性多糖不能与硼砂形成络合物，所以可将柱子处理成硼砂型的，用不同浓度的硼砂溶液洗脱，也能将不同的中性多糖分离开来。检测手段一般沿用苯酚-硫酸法，也常用LKB柱层析系统，用比旋光度、示差折光及紫外检测器，各组分的峰位自动记录，分离效果好且方便。

（4）凝胶柱层析

常用的凝胶有葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）以及Sephacryl。以不同浓度的盐溶液和缓冲液作为洗脱剂，其离子浓度不低于0.02mol/L，通过凝胶柱层析多糖可分为不同分子大小的糖。本法除进行多糖分级外，还可以用于小分子杂质的去除，或者在乙醇沉淀法进行分级后，再根据分子大小进一步分级。

（5）盐析法

根据不同多糖在不同盐浓度中具有不同溶解度的性质，加入不同盐析剂使不同多糖逐步析出，常用的盐析剂有NaCI、KCl和（NH4）2SO4等，其中以（NH4）2SO4效果最佳。

（6）其他方法：利用不同多糖分子大小、形状及电荷不同而在电场作用下达到分离目的的制备性电泳，分离效果较好。用己知超滤膜分离不同形状与分子量大小的多糖的超滤法，以多糖与抗血清产生选择性沉淀为原理的亲和层析法，以及具有快速高效特点的制备性高效液相层析法，已有效的应用于小规模纯品制中。此外，多糖的分级纯化方法还有冻融分级和超速离心等方法。