天山花楸叶中总黄酮范文

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【摘要】目的研究天山花楸中总黄酮最佳提取工艺。方法采用正交实验，分别以比色法测定总黄酮提出率和高效液相色谱（HPLC）图谱中总黄酮相对积分峰面积为指标，考察提取温度、料液比、醇浓度对天山花楸叶中总黄酮提出率的影响。结果最终确定天山花楸叶中总黄酮的最佳提取条件为：温度60℃，醇浓度为60％，料液比1∶10(g∶ml)，其中超声功率60kHz，时间30min，在相同条件下连续提取两次。结论该提取工艺合理，总黄酮提取率高，质量易于控制。

【关键词】天山花楸；超声提取；总黄酮；高效液相色谱图谱；相对积分峰面积

天山花楸SorbustianshanicaRupr为蔷薇科(Rosaceae)花楸属植物(Sorbus)，系新疆维吾尔族和哈萨克族民间用药，常用于治疗肺结核、哮喘、咳嗽、胃痛等症［1］。实验研究表明天山花楸叶具有平喘镇咳祛痰、依赖性地抑制心肌收缩和保护心肌缺血等作用［2］。本课题组药效筛选实验发现天山花楸中有效成分主要为黄酮类化合物。

天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，是许多中草药的有效成分，具有很高的药用价值。黄酮类化合物具有消除疲劳、保护血管、预防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、活化大脑及其他脏器细胞的功能［3］。药理作用表现为抗炎镇痛、抗病毒，抗辐射、抗癌抗肿瘤［4］，抗氧化、抗衰老、抗心脑血管疾病［5］，免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松等。传统的黄酮提取方法有浸渍法、索氏法、回流法等，提取时间较长,并影响提出率。超声提取是目前比较新的技术，超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，都可加速药物有效成分进入溶剂，从而提高了有效成分提出率,缩短了提取时间，节约了溶剂，并且避免了高温对有效成分的影响［6］，因此把超声技术用于中药有效成分的提取越来越受到重视。

1材料

美国AgilentHP1100型高效液相色谱系统（配有：四元泵，紫外检测器，HP1100化学工作站）；日本岛津UV2401（PC）紫外光谱仪；德国SartoriusBP211D十万分之一电子分析天平；SK5200HP超声清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯净水，磷酸、乙醇及其它试剂均为分析纯；芦丁对照品由中国药品生物制品鉴定所提供；天山花楸供试品采自新疆玛纳斯林场，海拔2000～2500m，由石河子大学药学院成玉怀高级实验师鉴定为蔷薇科(Rosaceae)花楸属植物(Sorbus)。

2方法与结果

2.1亚硝酸钠-硝酸铝比色法测样品中总黄酮含量芦丁标准曲线的绘制:精密称取芦丁对照品20mg于50ml量瓶中，超声溶解，用60％乙醇定容至刻度，摇匀备用。分别精密移取上述对照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0ml于25ml量瓶中加60％乙醇至6.0ml，加5%亚硝酸钠溶液1.0ml放置6min，加入8%硝酸铝溶液1.0ml放置6min，加入5％氢氧化钠试液10ml定容，放置15min后以试剂空白为参比溶液于510nm测吸光度。得回归方程为：Y＝12.058X－0.0028，r＝0.9999，芦丁在0.0162～0.0727mg/ml浓度范围内呈良好线性关系。其平均加样回收率为98.0％；RSD(n=3)为0.95%。

2.2HPLC分析

2.2.1色谱条件WatersC18柱(250mm×4.6mm，5μm)；检测波长360nm；温度25℃；运行时间30min；平衡时间10min；进样量20μl，梯度洗脱条件见表1。表1HPLC梯度条件（略）

2.2.2HPLC图谱在上述HPLC色谱条件下，样品中各组分的色谱峰分离度良好。结果见图1。

2.2.3HPLC分析指标建立本课题组药理实验证明，醋酸乙酯提取物为药理实验有效部位。经理化鉴定及TLC分析结果显示该有效部位呈黄酮类化合物阳性反应。通过对比图1中各样品HPLC图谱，在20～30min其共有峰保留时间和整体图貌具有良好的一致性。色谱分析中，化合物保留时间，取决于化合物特定的色谱行为，可以确定20～30min一系列色谱峰为黄酮类化合物色谱峰。因此，本实验选择积分HPLC图谱20～30min各组分色谱峰，计算相对积分峰面积（各组分积分峰面之和与样品质量的比值，记作：A/μg），对指标进行量化，并以此分析样品。

2.3正交实验设计结合预实验实际情况，选提取温度（A）、料液比（B）和乙醇浓度（C）为影响总黄酮提出的主要因素，每个因素取3个水平（见表2），选用L9（34）正交实验表安排实验，其中超声功率60kHz，时间30min，连续提取两次。精确称取天山花楸叶干粉2.0g，加入不同溶剂系统，平行提取条件下操作，按“2.1”项测定并计算总黄酮含量及相对积分峰面积。

表2因素水平

2.4正交实验结果及分析

由表3～4结果分析表明，以总黄酮含量为指标时，因素A对总黄酮提取实验影响显著，影响顺序为A>B>C，最佳提取工艺条件为A2B3C3；由表3，表5分析表明，以HPLC图谱相对积分峰面积为指标时，因素A、C对总黄酮提取实验影响显著，影响顺序为A>C>B，最佳提取工艺条件为A3B1C2。表3结果与极差分析（略）表4总黄酮含量为指标方差分析（略）表5相对积分峰面积为指标方差分析（略）

2.5最佳工艺条件验证实验通过以上实验，综合分析考虑，最终选用相对积分峰面积为指标，最佳提取工艺条件确定为A3B2C2，即提取温度为60℃，料液比为1/10g/ml，乙醇浓度为60％，其中超声功率60Hz，时间30min，连续提取两次。在此最佳工艺条件下平行进行3次实验，总黄酮提取率较高且稳定。

3讨论

3.1浸提溶剂的选择

黄酮类化合物的游离黄酮苷元和黄酮苷极性皆较大，因此较易溶于极性较大甲醇和乙醇以及相应的水溶液中，提出率较高；而醋酸乙酯和丙酮极性较小，相对提出率较低。乙醇相对甲醇而言毒性小，且本身具有杀菌作用，提取样品不易发霉变质，所以本实验选取乙醇为提取溶剂。

3.2检测波长的确定

精密移取芦丁对照品溶液2.0ml于25ml量瓶中加60％乙醇至6.0ml，加5%亚硝酸钠溶液1.0ml放置6min，加入8%硝酸铝溶液1.0ml放置6min，加入5％氢氧化钠试液10ml定容，放置15min后于400～800nm波长范围进行紫外扫描。结果表明，芦丁显色后在510nm处有最大吸收峰。

3.3显色条件考察

在预实验中参考有关文献的亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮含量时，发现短时间内样品吸光度值变化较大，准确度、精密度、重现性及回收率结果均较差。故本实验又重新考察了显色剂加入量、显色温度和显色时间，对比色条件进行了改进，确立了新的测定条件，即“2.1”项中测样品中总黄酮含量的方法。经重复性、回收率等实验分析表明，以此方法测定天山花楸中总黄酮含量，能够取得较为满意的结果。

3.4分析指标的确定

本实验以芦丁为对照品加入显色剂于400～800nm波长范围内扫描，其在510nm具有最大吸收，主要原因是其具有邻二酚羟基可与显色剂显色。但天山花楸叶醇提液中，除含有黄酮类化合物，绿原酸含量也较高［7］。绿原酸也具有邻二酚羟基可与显色剂显色，对天山花楸叶中总黄酮含量测定产生干扰［8］。实验表明以芦丁为对照品，以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH为显色剂，在510nm测定天山花楸叶醇提液中总黄酮含量的方法专属性不强、有局限性、准确性较差。而HPLC图谱显示，样品中各组分的色谱峰分离度良好，可以避免样品中其它组分干扰目标化合物的分析，专属性较强。且经初步实验验证20～30min为一系列黄酮类化合物的色谱峰。因此，本实验选择以HPLC图谱20～30min相对积分峰面积为指标来分析天山花楸叶提取样品。

3.5最佳工艺条件的确定

通过实验，以HPLC图谱中总黄酮相对积分峰面积为指标，确定了天山花楸叶中总黄酮的最佳提取工艺条件，其中料液比为1/8g·ml-1。但考虑到干燥花楸叶粉末吸水性较大，影响样品流动性，不利于循环超声提取，且由表5可知，料液比对总黄酮的提取无显著性影响，综合分析考虑将料液比确定为1/10g·ml-1。

3.6结论

与比色法测定总黄酮含量为指标相比，以HPLC图谱中黄酮类化合物相对积分峰面积为指标对样品的分析方法具有专属性强、准确度高、重复性好等特点，易于生药及制剂质量控制。以其确定的天山花楸叶总黄酮提取工艺合理，提取率稳定。新晨：

【参考文献】

［1］新疆自治区卫生厅，新疆中草药编写组.新疆中草药［M］．乌鲁木齐：新疆人民出版社，1975：92.

［2］于明，李铣．花楸属植物化学成分药理作用及其研究进展［J］．辽宁中医学院学报，2004，6(5)：364.

［3］肖坤福，廖晓峰．黄酮类化合物研究进展及应用［J］．食品研究与开发，2003，24(4)：13.

［4］YoshizawaY,KawaiiS,UrashimaM,etal．Differentiation-inducingeffectsofsmallfruitjuicesonHL-60leukemiccells［J］．JAgricFoodChem,2000,48(8):3177.

［5］TermentziA,KefalasP,KokkalouE．AntioxidantactivitiesofvariousextractsandfractionsofSorbusdomesticafruitsatdifferentmaturitystages［J］．Foodchemistry,2006,98(4):599.

［6］李苑，张敏．中草药中黄酮类化合物提取工艺的研究概况［J］．广东药学，1999，(9)：4.

［7］张芹，李鹏，唐辉，等．高效液相法测定天山花楸中的绿原酸含量［J］．时珍国医国药，2008，19（1）：59.

［8］张芹，李鹏，唐辉，等．天山花楸中总黄酮和槲皮素测定［J］．石河子大学学报，2006，24（6）：709.