糖尿病大鼠认知障碍分析范文

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摘要：

目的：探讨葡萄籽原花青素（grapeseedproanthocyanidinextracts，GSPE）对2型糖尿病大鼠认知障碍的影响。方法：Wistar大鼠随机分为对照组、实验组。实验组大鼠采用链脲菌素联合高脂饮食复制2型糖尿病大鼠模型。造模成功后，随机分成模型组，二甲双胍组（metformin，MET，140mg•kg-1•d-1，灌胃），GSPE低、中、高剂量组（GSPE1、GSPE2、GSPE3分别为20、40、80mg•kg-1•d-1，灌胃）。2个月后，观察各组大鼠Morris水迷宫学习能力、海马丙二醛（MDA）水平及超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果：与对照组比较，模型组定位航行和空间探索能力下降（P<0.05）；MET组、GSPE3组定位航行学习能力和空间探索能力明显高于模型组（P<0.05）。与对照组比较，模型组海马SOD活性明显降低（P<0.05），MDA含量明显增加（P<0.05）；与模型组比较，MET组和GSPE3组海马SOD活性显著增加（P<0.05），MDA含量显著降低（P<0.05）。结论：葡萄籽原花青素能改善2型糖尿病大鼠认知障碍，机制可能与增强SOD活性，清除过多的氧自由基，减少MDA的生成有关，并且葡萄籽原花青素的作用具有剂量依赖性。

关键词：

葡萄籽原花青素；2型糖尿病；认知障碍；学习记忆

2型糖尿病（Type2DiabetesMellitus，T2DM）是当前我国发展最快和危害最深的一种代谢性疾病，常伴有逐年增加的认知障碍，主要表现为学习记忆能力的减退[1]。目前关于导致糖尿病认知障碍的机制有很多，公认的有氧化应激学说、神经元凋亡学说、炎症学说等，其中氧化应激学说占有重要地位。氧化应激通过参与神经发生障碍，血脑屏障的变化，糖基化终产物生成增多及中枢神经细胞凋亡等多方面导致糖尿病认知功能的损伤[2-3]。因此，寻找一种具有抗氧化应激作用的药物是减轻2型糖尿病认知障碍的策略之一。葡萄籽原花青素（grapeseedproanthocyanidinextracts，GSPE）是从葡萄籽中提取出来的一类属于双黄酮衍生物的天然多酚化合物，是一种高效的抗氧化剂和自由基清除剂，且容易透过血脑屏障[4-5]。因此，葡萄籽原花青素极有可能改善糖尿病病人的认知障碍。本研究旨在观察不同剂量的葡萄籽原花青素对2型糖尿病大鼠认知障碍的影响，为葡萄籽原花青素的临床应用提供实验依据。

1材料

1.1动物及饲料健康3月龄雄性Wistar大鼠60只，清洁级，体质量为（195±16）g。常规饲料：57%碳水化合物，22%蛋白质，6%脂肪，8%纤维素，7%其它成分。高能饲料：60%常规饲料，20%蔗糖，15%猪油，5%胆固醇。动物及饲料均由川北医学院医学实验动物中心提供。动物合格证号：SYXK（川）2013-076。

1.2药物及试剂葡萄籽原花青素（天津尖峰天然产物有限公司，纯度>95%）；二甲双胍（上海医药有限公司信谊制药总厂）；链脲菌素（STZ）购自sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号：20131009）与丙二醛（MDA）试剂盒（批号：20131016）均购自南京建成生物工程公司；快速血糖测定仪及试纸（三诺SXT-1型，长沙）。

1.3仪器Morris水迷宫计算机图像实时分析系统（成都泰盟有限公司），HH.S21型恒温水浴锅（上海凯乐电子设备厂），752型紫外分光光度计（上海光学仪器厂）。

2方法

2.1动物模型制备T2DM大鼠模型建立参照本实验室既往方法[6]。自由进食饮水，适应性饲养1周后，按体质量随机分出对照组8只和实验组52只。对照组采用常规饲料饲养。实验组高能饲料喂养4周，空腹12h后一次性腹腔注射链脲菌素25mg•kg-1（注射前用pH=4.2的枸橼酸缓冲液配成1%浓度）。对照组注射等量的柠檬酸缓冲液，实验组继续高能饲料喂养4周后，采尾静脉血测空腹血糖（fastingbloodglucose，FBG），以FBG>7.8mmol•L-1作为2型糖尿病模型造模成功的判断标准[7-8]。

2.2分组及给药方法将成功造模的50只大鼠中随机分成模型组，MET组（140mg•kg-1•d-1），低、中、高GSPE剂量组（GSPE1、GSPE2、GSPE3分别为20、40、80mg•kg-1•d-1），每组10只。GSPE1、GSPE2、GSPE3组每日灌胃给予葡萄籽原花青素。MET组每日灌胃给予二甲双胍。模型组和对照组灌胃给予等容量生理盐水，连续给药2个月。各组大鼠在用药期间自由饮水，进食。

2.3Morris水迷宫行为学测试给药2个月后，参照Morris水迷宫法进行定向航行实验和空间探索实验，测试6d（继续给药），Morris水迷宫平台固定置于第4象限中央，浸没于水下2cm，水温（25±1）℃。第1~5日进行定向航行实验，每天分上、下午两个时段，每个时段1次，分别从4个不同的标记点，将大鼠于象限边缘中点头朝池壁放入水中，记录2min内大鼠从入水到爬上对角线象限的平台所需时间（即逃避潜伏期）。第6日进行空间探索实验，即撤去平台，任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录2min内大鼠在各象限的游泳时间和跨越原平台所在位置的次数。

2.4海马组织SOD和MDA含量的测定Morris水迷宫行为学测试后，各组大鼠麻醉后断头取脑，并迅速取出海马组织，滤纸吸干剪碎后置于匀浆机中，按照各试剂盒说明书要求进行检测。

2.5统计学分析数据用x—±s表示，应用SPSS16.0统计软件进行处理，对结果比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1一般情况观察对照组大鼠一般情况良好，精神状态佳，活动自如，毛发光泽，饮食及大小便正常，无死亡。模型组大鼠一般情况差，精神萎靡，活动减少，毛发晦暗，出现明显的多饮，多尿，多食的症状。模型组大鼠因感染死亡一只。各给药组上述情况均有不同程度改善。

3.2对2型糖尿病大鼠学习记忆的影响

3.2.1定位航行实验各组大鼠平均逃避潜伏期随着游泳天数的增加而不断下降，说明各组大鼠游泳训练期间学习寻找平台的能力逐渐提高。第1、2天各组间差异不明显，训练后3d，与模型组比较，对照组大鼠平均逃避潜伏期时间显著缩短（P<0.05）；与模型组比较，MET组、GSPE3组平均逃避潜伏期时间小于模型组（P<0.05），见表1。

3.2.2空间探索实验对照组穿台次数明显多于模型组（P<0.05）；MET组穿台次数明显多于模型组（P<0.05）；GSPE3组穿台次数明显多于模型组（P<0.05）。

3.3对各组大鼠海马组织中SOD活性和MDA含量的影响模型组与对照组比较，SOD活性降低，MDA含量增高（P<0.05）。MET组、GSPE3组与模型组比较，均降低了MDA含量，增加了SOD活性（P<0.05）。4讨论2型糖尿病认知功能障碍是以获得性认知行为缺陷为特征的糖尿病慢性并发症。有研究显示，2型糖尿病的早期阶段就可有认知功能减退的表现[9-10]。本实验结果显示在成功复制2型糖尿病后2个月的模型组大鼠，Morris水迷宫检测其空间学习记忆的能力已明显低于对照组，证明2型糖尿病大鼠在早期即存在认知功能障碍，与文献报道一致。用葡萄籽原花青素干预治疗的大鼠空间学习记忆能力明显高于模型组大鼠，显示长期给予葡萄籽原花青素能很好的改善2型糖尿病大鼠学习记忆能力。目前研究表明氧化应激是导致2型糖尿病认知功能障碍的主要机制。氧化应激是指组织或细胞中自由基与抗氧化物比值的不平衡状态。SOD是体内主要的抗氧化酶，清除超氧阴离子，保护组织或细胞免受氧化应激的损伤；MDA为脂质过氧化代谢产物，其水平增高时，可引起明显的细胞或组织损伤。因此如果组织中的SOD活性增加，MDA含量减少就可以反映对细胞或组织的保护作用。目前已知海马是人和大鼠学习、记忆有关的重要脑结构，并且海马神经元在学习、记忆中起重要的整合作用[11]。因此本实验选择海马作为观察的靶点。

实验中观察到模型组大鼠学习记忆能力下降，并且海马组织中SOD活性降低，MDA含量增加；而二甲双胍组和葡萄籽原花青素高剂量组大鼠学习记忆明显提高，同时能显著提高海马组织SOD活性，降低MDA含量。由此，可以推测2型糖尿病大鼠学习记忆的下降与氧化应激致使海马受损有关。而葡萄籽原花青素能增加2型糖尿病大鼠海马中SOD活性和降低MDA含量，减轻氧化应激的损伤，改善2型糖尿病大鼠学习记忆的能力。因此，证实猜测葡萄籽原花青素改善2型糖尿病大鼠海马空间学习能力是通过调节氧化应激机制，减轻糖尿病认知功能的损伤，从而促进学习记忆的能力。

综上所述，氧化应激所致海马受损是2型糖尿病大鼠认知障碍的原因之一，葡萄籽原花青素可以通过提高2型大糖尿病鼠海马SOD活性，降低MDA含量，减轻氧化应激损伤，从而提高2型糖尿病大鼠空间学习记忆能力。

参考文献

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[11]罗焕敏.海马结构—从形态、功能到可塑性、衰老性变化[J].神经解剖学杂志，1996，12(1)：177-184.

作者：刘行海 买文丽 郑倩 刘华 张建武 刘红 单位：川北医学院