肝细胞生物学论文范文

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1材料与方法

1．1组织块贴壁法分离培养hUC-MSCs脐带取自正常分娩的新生儿(征得其父母同意)。首先用含双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗脐带3次，去除杂物;用无菌的手术剪刀将脐带剪成3～4cm的节段，再沿长度方向剪开，以暴露脐带胶质部分，去除血管;置于含双抗的PBS中清洗3次，去除血污，再剪成约0．5cm3的组织块，以胶质部分贴于基底平铺于24孔板中，每孔2～3块，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育1～2h;待组织块自然粘附于皿底部后加入含双抗、FBS的低糖DMEM培养基，继续置于培养箱内培养，每3d更换一次培养基，待观察到有小三角形或梭形细胞从组织中铺展出时，取出组织块。整个分离过程注意无菌操作。待细胞生长至70%～80%汇合时，即可传代。利用倒置相差显微镜观察细胞形态。取第5代细胞，采用细胞免疫荧光技术鉴定hUC-MSCs的表面标记物CD44。

1．2肝细胞标志基因的检测按照总RNA提取试剂盒的操作说明分别提取hUC-MSCs和人肝癌细胞HepG2的总RNA，用RNase-FreeDNaseⅠ去除基因组，最后检测RNA的浓度和纯度，立即进行反转录合成cDNA或保存于－80℃备用。采用Prime-ScriptTMⅡHighFidelityRT-PCR试剂盒反转录2μgRNA得cDNA，取2μL用于PCR。根据GenBank提供的人肝细胞标志基因序列，使用PrimerPremier5．0软件设计引物，引物序列和产物大小见表1。GAPDH为内参对照。PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环;最后72℃延伸5min。PCR产物用20g/L的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶分析系统下拍照。

1．3PAS糖原染色按照PAS染色试剂盒的说明书操作，对第5代hUC-MSCs和HepG2进行糖原染色，在倒置相差显微镜下观察并照相。

2结果

2．1hUC-MSCs的分离、培养、传代及鉴定组织块贴壁培养3～4d时，可观察到组织块间隙铺展出小三角形或长梭形的细胞，继续培养至7d左右，可观察到局部细胞呈集落生长，此时，在无菌条件下取出组织块，更换新鲜培养基，继续培养1周左右，细胞可达80%～90%汇合，即可传代。用胰酶/EDTA消化后细胞呈亮而圆的单个分散状，以1∶3的比例进行传代，约4h贴壁，2d后迅速生长。倒置相差显微镜下可观察到细胞较大，轮廓清楚，内部有清晰的应力纤维，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显，呈典型的成纤维细胞样形态(图1A);持续培养大约2周时，细胞基本达到完全汇合，形态发生一定的变化，胞质变得狭窄，内部的应力纤维也不明显，呈平行排列或漩涡生长(图1B)。连续多次传代，细胞保持稳定的、相对均一的成纤维细胞样形态以及较强的增殖能力。经鉴定分离培养的细胞CD44呈阳性表达，且具有良好的均质性。

2．2肝细胞标志基因的表达以HepG2作为阳性对照，用RT-PCR检测hUC-MSCs的肝细胞标志基因的表达情况，结果见图2，hUC-MSCs表达ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，不表达TAT。

2．3PAS糖原染色结果对hUC-MSCs和HepG2进行PAS糖原染色，染色结果显示两种细胞的细胞质中均有紫色颗粒物形成，即均呈糖原阳性反应(图3)。

3讨论

MSCs能分泌多种细胞因子和生长因子，具有直接或间接的抗炎及抗纤维化作用，可抑制肝细胞的死亡和纤维化;还可通过其分泌物抑制肝细胞的凋亡、刺激肝细胞再生、为受损肝细胞提供营养支持等。MSCs还具有低免疫原性及免疫抑制力，适用于进行同种异体移植，在移植后可迁移、归巢至受损的组织，发挥治疗作用。因此，MSCs在肝脏疾病的细胞移植治疗中具有广阔的应用前景。研究发现，相较不同来源的MSCs，脐带来源的MSCs不仅具有干细胞的特性，而且来源丰富、取材方便、增殖能力较强、无伦理法律限制，还具有较低的免疫原性和分化程度，从而成为一个非常有吸引力的移植治疗肝病的细胞来源。

作者采用组织块贴壁培养法从脐带基质中分离获得hUC-MSCs，与酶消化法和流式细胞仪或免疫磁珠分选法相比，该分离方法操作简单，消耗低，易于控制。分离培养的hUC-MSCs呈典型的成纤维细胞样形态，具有MSCs的表型特征，均质性良好，且在体外长期培养中能保持稳定状态。进一步的RT-PCR结果显示，培养的hUC-MSCs同时表达成熟肝细胞的标志基因ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，而不表达TAT，与Campard等的研究结果一致，提示hUC-MSCs可能具有肝细胞的一些相关功能，如合成白蛋白、合成糖原及解毒功能等;PAS糖原染色结果则证明hUC-MSCs具有糖原合成和储存能力。

但上述结果并不能证明hUC-MSCs为成熟的肝细胞，在其他组织如卵巢、胰脏内也可发现ALB、角蛋白的表达。综上所述，组织块贴壁培养法可有效获得稳定、均质性良好的hUC-MSCs，其本身同时表达多种成熟肝细胞的标志基因并具有一定的肝细胞功能，可能更适宜于作为诱导性肝细胞的起始细胞或直接代替肝细胞用于移植治疗相关的肝脏疾病，从而满足基础研究与再生医学领域尤其临床应用对肝细胞的需求。

作者：李丽丽王巧燕代克强丁一樊晋宇单位：河南师范大学生命科学学院