扇头蜱分子生物学论文范文

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1材料与方法

1.1采集地点的选择伊宁县位于东经80°13′～82°42′，北纬43°35′～44°29′之间，东邻尼勒克县，西与伊宁市和霍城县接壤，南邻伊犁河，与察布查尔、巩留两县隔河相望。同时，位于伊犁河谷中部，水草丰富，境内的伊宁口岸是伊犁地区重要的贸易口岸。

1.2实验材料

1.2.1蜱的来源2013年4－5月，从伊宁县的2个采集点、2个绵羊群，每群＞30只，均未药浴，采集其体表寄生蜱，共获得硬蜱324只，放置于潮湿阴暗处，以保持其存活。

1.2.2主要试剂PCR所用试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；DNA提取试剂盒（DNeasyBloodTissueKit）购自德国Qiagen公司；其他试剂均为分析纯。

1.3实验方法

1.3.1蜱种鉴定参照《中国经济昆虫志》［9］，用普通解剖显微镜将324只蜱进行形态学鉴定，初步分类后，从中选取50只用配备数码照相功能的解剖显微镜（LEICAM165C）拍摄图片，对蜱的盾板、假头、假头基、肛侧板、气门板、第一缘垛、孔区（雌蜱）等形态进行对比观察并测量［11］。1.3.2蜱的处理和DNA提取将蜱标本分别依次用浓度为70%、50%、30%、10%的乙醇溶液于37℃摇床中振荡冲洗1h，再用超纯水反复冲洗，干燥。最后置于消毒灭菌的1.5mlEP管中。按照DNA提取试剂盒使用说明书提取虫体基因组DNA，置-20℃保存备用。

1.3.3基因扩增用上游引物5′-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3′，下游引物5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3′扩增线粒体16SrRNA序列［12］；上游引物5′-CAAAAWCCTGGTAAAATTAAA-3′和下游引物5′-GCACTATCAAGCAACACGACT-3′扩增COⅠ序列［10］。25μlPCR反应体系：模板1.5μl（约50ng），上游和下游引物各0.75μl（75pmol），50mmol/LKCl，10mmol/LTris⁃HCl（pH8.3），1.5mmol/LMgCl2，1单位TaqDNA聚合酶。PCR反应循环参数为：①16SrRNA为94℃预变性5min，92℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共38个循环，72℃终延伸8min。②COⅠ为94℃预变性5min，92℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s，共38个循环，72℃终延伸8min。扩增片段后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。1.3.4序列分析及系统进化树构建结合GenBank登录的图兰扇头蜱的16SrRNA和COⅠ参考序列，将本实验PCR扩增的6条16SrRNA及6条COⅠ序列测序结果与参考序列比对，运用Mega5.0软件的ClustalX程序分析，计算遗传距离并构建遗传进化树。

2结果

2.1蜱种鉴定所鉴定蜱共324只（168♂、156♀），虫体体型较小，雌虫体长3.2～5.5mm，雄虫体长2.9～3.6mm，呈褐色，背腹扁平似卵圆形，芝麻至米粒大，雌蜱饱血后可膨胀达蓖麻籽大。体分为假头和躯体两个主要部分（图1A）。假头基呈六角形，侧角明显，后缘微凹（图1B）。雄蜱盾板覆盖整个背部，雌蜱盾板覆盖背前部，前部较窄，后部圆钝，盾板遍布刻点，以细刻点居多，粗刻点少而零散（图1C）。眼卵圆，靠近盾板前部边缘。须肢粗短，中部最宽，前端稍窄。雄蜱气门板长卵形（图1D）。体端有缘垛，中垛大于边垛，常有尾突（图1E）。有肛沟，雄性肛侧板后缘内斜明显，内缘具角突，长约为宽的2.5～3.0倍，内缘中部稍凹，后缘向内显著倾斜，其后方凸角明显（图1F）。结合有关文献［9，13］认为伊宁县的蜱具有硬蜱科扇头蜱属图兰扇头蜱的特征。但由于吸血、饱血雌蜱及部分未成熟或形态变异的雄蜱，仅用传统形态学分类方法不能准确区分。因此，从324只中选出6只雌雄分别具有形态差异的蜱（4♂、2♀），根据采集地点分别将其命名为YN-1、YN-2、YN-3、YN-4、YN-5和YN-6。YN-1为当地典型雄性图兰扇头蜱；YN-2和YN-3为半饱血雌蜱，因其腹部吸血膨胀已无法观察缘垛，肛侧板和副肛侧板难以区分形态且边界不清；YN-4、YN-5和YN-6为部分形态特征改变雄蜱，YN4和YN5体端较宽似倒置三角形与典型的图兰扇头蜱卵圆形体端不同，且YN5气门板呈长逗点形与血红扇头蜱气门板相似；YN6肛侧板后缘圆钝，凸角不明显。因此对这6只蜱采用分子生物学方法进一步分析，对上述形态学鉴定结果进一步验证。

2.2分子生物学鉴定

2.2.1PCR扩增通过PCR扩增上述形态学差异较大的6只图兰扇头蜱线粒体DNA，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，均获得特异性很好的PCR产物，与预期目的片段一致（16SrRNA约为460bp，COⅠ约为760bp）。

2.2.2图兰扇头蜱16SrRNA和COⅠ基因片段组成利用Mega5.0软件计算6只图兰扇头蜱的16SrRNA和COⅠ基因片段碱基组成。16SrRNA基因片段A、T、C、G的平均碱基含量分别为36.68%、37.12%、10.7%和15.5%，碱基A＋T平均含量是73.78%。COⅠ基因片段A、T、C、G的平均碱基含量分别为38.56%、31.78%、14.12%和15.54%，碱基A＋T平均含量是70.34%。

2.2.3图兰扇头蜱基因序列比对及系统进化树运用Mega5.0软件的ClustalX程序进行多重序列比对后，16SrRNA获得2种不同序列，并登录GenBank，登录号分别为KF547987和KF547989；COⅠ获得3种不同序列，登录号分别为KF688136、KF688137和KF688138。各结合GenBank登录的3种扇头蜱的参考序列构建系统进化树。6只图兰扇头蜱16SrRNA基因片段的遗传变异很小，共检测出2个单倍型，1个变异位点。其中YN-2、YN-3、YN-4和YN-5序列相同，为一种单倍型；YN-1、YN-6在216位点处为转换位点（T-C），为一种单倍型。基因序列比较结果显示同源性均在99.5%以上，遗传距离为0.3%～0.5%。而上述6只图兰扇头蜱的COⅠ基因片段序列变异较大，共检测出3个单倍型，4个变异位点。YN-1、YN-2和YN-6序列相同，为一种单倍型；YN-3和YN-5检测到3个变异位点，均为转换位点（A-G），无插入/缺失和颠换现象；YN-4在上述变异基础上，于574位点处发生转换（A-G）。基因序列比较结果显示同源性均在98.6%以上，遗传距离为0.3%～1.9%。

3讨论

调查结果表明新疆伊宁县绵羊体表普遍寄生了图兰扇头蜱，据以往报道图兰扇头蜱主要分布于新疆的巴楚、喀什、霍城、和田、哈密、呼图壁、库尔勒、轮台、阿瓦提、沙雅、于田等荒漠草原和荒漠地区［14］。而伊宁县地处亚欧大陆腹地，伊犁河谷中部，属中温带干旱型内陆山地气候，该地区气候温和，水源充沛，水草丰茂，以往并不适合图兰扇头蜱的生存繁殖，而此次在伊宁县发现图兰扇头蜱分布普遍，可能与新疆北疆近30年雨水过少、特殊的植被分布及气候改变有关。线粒体基因已成为群体遗传学和进化生物学研究中的重要分子标记。Murrell等［15］认为线粒体基因对于分子进化的研究具有很大价值，且更适于种内遗传差异的分析。目前蜱类研究中用的最多的线粒体基因为12SrRNA、16SrRNA、COⅠ和COⅡ等基因［10］。线粒体上的不同基因具有不同的解析功能，同一基因在不同的物种间也具有不同的解析能力。并且，在系统发育研究中多个数据比单个数据的效果要好，16SrRNA基因序列由于其保守性和存在的普遍性，被大量用于蜱类的物种鉴定和系统研究［12，16-17］。COⅠ基因是线粒体呼吸链末端的一个催化酶，比其他基因在生化功能的研究上更完备，普遍存在于真核生物和原核物细胞的线粒体中；此外，COⅠ基因是核基因组以外独立的线粒体环状DNA，所以能够用来比较其在生物进化上的相互关系［18］。吕继洲等［19］通过16SrRNA和COⅠ基因鉴定小亚璃眼蜱（H.anatolicum）、亚洲璃眼蜱（H.asiaticum）和残缘璃眼蜱（H.detritum）3种形态上极其相近的蜱种。一般来说，在变异程度上16SrRNA基因较COⅠ基因明显保守［20］，本实验研究结果也证实了这一观点。并且，通过对2个基因的研究发现，该地区图兰扇头蜱种内遗传差异显著，证实图兰扇头蜱具有生物多样性。由于蜱传播病原体一般与蜱种之间存在着一定的对应关系，亲缘关系越近的蜱种，其传播相同病原体的机会越大［21］。因此，不同蜱种的种内遗传差异与蜱传疾病的变化仍需进一步研究，为蜱媒病的预防控制提供依据。

作者：杜景云牟路萌张璘王丽娜王安东张科陈创夫王远志单位：新疆石河子大学医学院山东省济南市中心医院新疆石河子大学动物科技学院河南省平顶山学院新农村发展研究院