乳腺癌术淋巴结冰冻切片质量提高研究范文

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摘要：目的分析淋巴结冰冻切片的影响因素，以提高淋巴结冰冻切片质量。方法收集我院2016年1月~2018年12月临床送检的331例乳腺癌术中前哨淋巴结冰冻切片，通过对取材、包埋、制片等各个环节的分析，探讨冰冻制片中出现的问题，总结冰冻切片的操作技巧和改良方法。结果331例前哨淋巴结冰冻活检中，有2例出现假阴性，石蜡切片病理诊断发现微转移灶2mm。其余冰冻切片质量较好，组织结构完整，细胞形态清晰，染色分明，少有冰晶形成。结论通过规范操作细节调整改进，制作高质量冰冻切片，对诊断乳腺癌前哨淋巴结是否转移特异性较高，是一种较为可靠而快速的诊断方法。

关键词：前哨淋巴结；冰冻切片；乳腺癌；制片

前哨淋巴结（sentinellymphnode，SLN）是原发肿瘤引流区域淋巴结中的特殊淋巴结，是原发肿瘤发生淋巴结转移所必经的第一批淋巴结，其组织病理学状态可代表整个区域淋巴结的可能状态。前哨淋巴结活检能较准确的评估早期乳腺癌患者的腋窝淋巴结状态[1]。前哨淋巴结的术中冰冻切片检查是乳腺癌患者腋窝淋巴结状态的有效且可靠的预测指标[2，3]，故前哨淋巴结术中冰冻切片准确诊断极为重要。冰冻切片检查可以最早的了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，以利于确定是否需要彻底扫除腋窝淋巴结或者其它的治疗措施。但冰冻切片是在低温恒冷条件下，使组织迅速冷冻达到一定硬度制成的切片，一般要求15min内完成，在制片工作中存在局限性，尤其淋巴结组织细胞致密，组织低温易脆，制片存在困难，故本文将乳腺癌术中前哨淋巴结传统制片方法加以探讨与改进，以期不断提高淋巴结的术中冰冻切片质量。

1资料与方法

1.1一般资料

收集河北医科大学附属沧州市中心医院2016年1月~2018年12月收治的331例临床原发性乳腺癌女性患者的手术中切除前哨淋巴结送检病理组织。

1.2方法

1.2.1仪器及材料采用德国产LeieaCM1950型恒温冷冻切片机，OCT包埋剂，AAF固定液，苏木素伊红染液，梯度酒精，二甲苯。

1.2.2取材术中送检新鲜淋巴结剔除脂肪组织，沿长轴取材，厚度0.2~0.3cm，如果淋巴结体积较小，则去除脂肪直接包埋切片。

1.2.3包埋将取材淋巴结置于-18℃冷冻切片机内组织样本托上，样本托需提前放置恒温冷冻切片机内制冷，先加少量包埋剂打底，然后迅速放置组织，在组织周围二次加包埋剂稳固，待组织固定后，将冷冻锤轻压在组织表面，使组织和周围的支撑剂平整，冷却后切片。

1.2.4制片淋巴结切片厚度4~5μm，将组织粘附于载玻片下2/3与下1/3交界处，取片完成后立即放入AAF混合固定液（95%乙醇85ml、40%甲醛10ml、冰醋酸5ml）中充分固定[4]。AAF混合固定液能迅速固定染色质，且固定效果均匀，固定时间至少1.5min，固定后切片充分水洗，harris苏木素及伊红染色，梯度酒精脱水二甲苯透明中性树胶封片。

1.2.5固定冰冻组织块冰冻制片完成，再发完冰冻报告后冰冻组织块及时取下投入固定液，继续下一步石蜡常规脱水处理程序。

2结果

331例前哨淋巴结冰冻活检中，有2例出现假阴性，石蜡切片病理诊断发现微转移灶2mm。余冰冻切片平整，厚薄均匀、无皱折，镜下淋巴结结构完整，染色鲜明，细胞形态清晰，无肿胀及明显收缩，无空泡及少有冰晶形成，完全满足诊断需要（图1），若操作不当，造成淋巴结结构破碎，组织空洞，细胞挤压影响阅片诊断（图2）。

3讨论

提高乳腺癌术中前哨淋巴结快速冰冻切片质量，涉及取材、包埋、切片等各个环节。乳腺癌术中送检前哨淋巴结往往脂肪包裹，由于脂肪组织冷冻效果差，取材尽量剔除脂肪组织，对于难以剔除脂肪组织，可以用吸水吸油擦手纸或者厨房纸轻柔按压尽量吸去脂肪效果较好，注意动作轻柔勿压伤细胞。之后沿长轴取材淋巴结，组织厚度≤0.3cm，注意取材过厚延长冷冻时间，容易产生冰晶，影响镜下阅片诊断，传统组织取材厚度≥0.5cm影响制片效果。组织包埋时，一般实验室样本托在常温放置，冰冻操作过程中会延长组织与样本托固定与冷冻时间。本研究中将样本托提前放置于恒温冷冻切片机中预冷，可以使组织迅速冷冻。滴加包埋剂放置组织，在组织周围二次加包埋剂稳固，待组织底部固定后用冷锤按压，避免重压组织导致过度变形，实验发现组织取材薄平整，预冷样本托，冷锤冷却按压可以加速组织冷冻。对于送检多个淋巴结，需准备多个样本托分别冷冻，切忌不能将送检所有淋巴结放到一个组织样本托制片，增加切片难度。对于个别淋巴结组织体积较小，可以由包埋剂充分包裹制片有利于切出完整带被膜淋巴结组织，避免卷边。另外，市售液体胶水可以替代进口包埋剂，切片效果良好，且经济简便价格低廉，可以作为很好的替代品[5]。注意包埋剂用量，包裹组织但不可过量，以免延长冷冻时间。恒温冷冻切片机一般冷冻工作室温度控制在-24℃~-20℃，淋巴结组织冷冻后易变脆，切片易碎裂，温度不能太低，一般在-18℃~-17℃比较合适[6]。我们将冷冻工作室温度调至-18℃制作淋巴结冰冻切片，对于送检部分脂肪浸润淋巴结组织，冷冻难以制片，徕卡LeieaCM1950型恒温冷冻切片机可以启动单独样本头速冻功能，将冷冻样本头温度下降至-50℃~-35℃切片，切片完成后上调与恒温冷冻切片机冷冻工作室温度一致或高于冷冻工作室温度，以保护压缩机，提高冰冻切片机使用寿命。切片时注意动作均匀摇动把手，不可用力过猛，动作轻柔，右手拿载玻片轻轻平稳地压组织，使其平整地吸附在载玻片上。在贴附组织时可顺着一个方向稍微用力轻轻一带，帮助组织平展，但不可用力过猛牵拉出现组织变形挤压或者空洞破碎。冰冻取片时注意一次性粘附组织片，传统手法可能一张载玻片多次粘附动作，这样虽然粘贴组织多，但前期取片组织镜下观察往往易发生退变，可以利用防卷板一次性多切片，然后一起粘附。对于淋巴结怀疑有转移者，应连续切片间隔取片3~4张，充分显示不同层面病变做到不遗漏。如在冰冻切片中，淋巴结组织冷冻过脆出现破碎小裂口，或者呈粉沫状，解决办法是打开观察窗戴薄膜手套用手将组织块暖一下，或将组织取出来在室温中停留片刻，令其迅速回暖再行切片，这样就能切出完整连续的切片[7]，注意时间不可过长。切片完成后应立即将切片放入固定液中，固定的作用是使蛋白质变性、凝固、沉淀，保持细胞、组织原有的形态[8]，及时固定使切片细胞核结构清晰，切忌在室温中停留干燥再固定，否则容易造成细胞退变，丧失组织原有结构。在室温高或空气干燥的情况下，室温越高，退变速度越快[9]。固定时间要充分，至少1.5min，固定后水洗也要充分，彻底洗去多余的固定液和包埋剂，注意这两个时间不可省略。如冰冻取片后吹风机吹干固定，梯度酒精脱水后吹干封片，都易导致细胞退变皱缩。冰冻制片完成，再发完冰冻报告后冰冻组织块取出流水冲洗脱离样本托立即投入10%中性甲醛固定液中，固定组织细胞形态结构，避免组织自溶，保存细胞抗原性不丢失，注意不可以常温等待自然融化。冰冻组织块在处理完冰冻报告后常规行石蜡脱水处理程序，组织学制片石蜡病理诊断验证术中冰冻报告。在331例前哨淋巴结冰冻活检工作中，发现有2例出现假阴性，石蜡切片病理诊断发现微转移灶2mm，冰冻制片未发现，考虑冰冻组织切面浅未切上，总结工作经验，冰冻制片还需多切面多取片。余冰冻石蜡相吻合，冰冻与石蜡诊断符合率达99.40%。综上所述，制作高质量冰冻切片，还需要规范操作，细节调整改进，才能不断提高冰冻切片质量。术中冰冻切片可以可靠地评估乳腺癌患者前哨淋巴结活检的状态，能够避免大多数女性的二期手术，在早期乳腺癌患者手术中使用前哨淋巴结冷冻切片及冰冻诊断为临床制定进一步手术方案提供了可靠依据。

参考文献：

[1]叶春梅,高丹,黄自明,等.前哨淋巴结冰冻切片检查在乳腺癌手术中的应用价值[J].临床外科杂志,2015,23(10):763-765.

[4]张伟,彭大云,周永梅,等.LeicaCM1950自动恒温冷冻切片机在冷冻切片中的应用[J].医疗卫生装备,2017,38(10):129-131.

[5]傅世祥,刘亮,王志玲,等.冷冻切片制作的质量控制[J].诊断病理学杂志,2018,9(25):666-668.

[6]连爱琼.快速冰冻切片技术在病理诊断中的应用分析[J].医学理论与实践,2016,29(16):2251-2252,2267.

[7]刘敏,罗彦丽,唐娟.病理术中冰冻切片特殊组织的制片技巧及应用体会[J].南通大学学报(医学版),2016,36(3):225-227.

[8]董芸蓉.高质量冷冻切片的制作技术探讨[J].临床与实验病理学杂志,2016,32(3):349-350.

[9]丁伟,王德田,董建强,等.简明病理学技术[M].杭州:浙江科学技术出版社,2014:46-51.

作者：刘春荣 张荣菊 田亮 郭效忠 张晓玲 单位：河北医科大学附属沧州市中心医院病理科