口腔医学富血小板纤维的讨论范文

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20世纪末，随着基于生长因子的细胞治疗概念的提出［1］，血小板浓聚物的开发成为新的研究热点。富血小板血浆(platelet-richplasma，PRP)作为第一代的血小板浓聚物，自1998年首次提出以来［2］，广泛应用于促进软硬组织的愈合再生，涉及整形外科、运动医学、口腔颌面外科、牙周病学等多学科［3］。由于PRP在制备过程中应用牛凝血酶和氯化钙对血液进行处理而存在潜在的免疫原性危险［4］，促使了更安全的第二代血小板浓聚物，即富血小板纤维(platelet-richfibrin，PRF)的产生，其最早由法国Choukroun等［5］提出。PRF制备简单，无需对血液进行处理，在临床上具有广阔的应用前景。本文就近年来PRF在口腔医学的研究进展作一综述。

1PRF的制备

由Choukroun［6］提出的PRF(Choukroun''''sPRF)制备方法如下:抽取10ml静脉血，立即在400g离心力下离心10min;离心后血样分成三层:底层红细胞层，上层无细胞血浆，中间层即PRF。由于血液收集后很快会凝固，所以获得可用的PRF关键在于操作要迅速。临床上常用两层纱布轻柔挤出PRF中血清以获得操作性能良好的PRF纤维膜。另一种PRF由美国CascadMedical的FibrinetPRFM设备生产，这种富血小板纤维制备技术需两步离心、类似于PRP的制备技术。制备时虽不加牛凝血酶，但仍需加入柠檬酸钠抗凝剂、分离白细胞的凝胶和氯化钙，相较Choukroun''''sPRF制备昂贵且仍存在潜在的危险［7］。文献中PRF这一术语通常就是指Chouk-roun''''sPRF，本文亦然。

2PRF的成分和结构

PRF为富含血小板和白细胞的纤维凝胶，其内含有多糖链和各种结构糖蛋白，如纤连蛋白、纤维原等。DohanEhrenfest等［8］测得血液中接近97%的血小板、大于50%的白细胞浓聚于PRF凝块中。PRF内血小板和白细胞活化后能释放出细胞因子，主要的血小板生长因子有转化生长因子(transfor-minggrowthfactorβ-1，TGFβ-1)、血小板衍生因子(platelet-derivedgrowthfactors，PDGFs)和类胰岛素生长因子(insulin-likegrowthfactors，IGFs)［9］;白细胞分泌的调节因子主要有白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)-α等促炎因子和抗炎因子IL-4以及血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)［10］。DohanEhrenfest等［11］研究表明，PRF膜在7d内缓慢释放约273．4ngTGFβ-1和50．3ngPDGF-AB;第一天释放的量约为7d总量的40%，之后速度减慢，最后两天释放约占总量10%。而Su等［12］研究发现PRF制备5h后释出液中的PDGF-AB、TGFβ-1、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)和VEGF总量能分别达到52．73ng、72．21ng、3．23ng和1．04ng，且前三种生长因子分别占血小板总容量的17%、55%和82%，而IGFs则保持在249．16ng。这与He等［13］研究结果基本一致，其证实PRF中TGFβ-1和PDGF-AB在7d内释放的总量分别超过150ng和50ng，并且在28d后仍然能以ng水平大量释放。尽管这些研究在具体数值上存在差异，可能与制备时所得的PRF量和检测方法不同有关，但均证实PRF能长时间的释放大量的生长因子，提示PRF应用于临床时能使这些生长因子的作用更长久，而丰富的生长因子能加速组织的愈合和再生。组织学分析PRF凝块表现为三个区域，即红血栓区、无细胞纤维区和两者之间富含血小板的血沉棕黄层，血小板主要集聚在红血栓侧，提示PRF凝块近红血栓的一侧更具临床应用价值;而多糖链则分布于纤维区，且随纤维的网格状结构走行，对小循环分子有高亲和力，提示PRF具有支持细胞迁移和组织愈合的功能［9］。对PRF制备后析出的上清及释出液进行生化分析，发现其中TGFβ-1、PDGFs、IG-Fs、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4和VEGF的含量极低，说明这些生长因子主要存在于PRF中;而同样进行凝胶电泳也显示纤维蛋白原、纤维连接蛋白等参与纤维网架形成的蛋白缺失，提示多种多糖链、结构性糖蛋白是完全捕获在PRF膜中的，说明PRF膜中含有丰富的纤维［9－10，12］。纤维在组织愈合过程中有重要的作用，损伤区周边上皮细胞最终迁移至纤维基质，加速损伤软组织的覆盖;而在神经血管化作用下，纤维能捕获循环干细胞到损伤区，并为干细胞分化提供支持基质，提示PRF能保护损伤区、促进软组织愈合，在组织工程中能支持移植的干细胞而促进组织再生。Kang等［14］分别观察了新鲜的和冻干的PRF结构，在新鲜的PRF纤维区可观察到大量的白细胞和血小板聚集，进一步证实PRF富含白细胞和血小板;而冷冻的PRF则显示了其独特的蜂窝状结构，提示PRF有捕获细胞的功能，可促进组织愈合。

3PRF体外研究

Dohan等［15］分别用四种人细胞在体外与PRF共同培养12h、24h、3d和7d，通过四氮唑盐比色法(MTT)评估琥珀酸脱氢酶活性，检测PRF对细胞呼吸的影响，结果表明PRF不影响细胞的琥珀酸脱氢酶活性，甚至使角质细胞和前脂肪细胞呼吸作用更好。该实验证实PRF对人体无毒性，是一种安全的生物材料。PRF富含多种细胞增殖和分化所需的生长因子，能明显促进口腔颌面部相关细胞的增殖和分化。Tsai等［16］研究证实PRF能刺激牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞和成骨细胞的增殖，而对口腔上皮细胞的生长有抑制作用，提示PRF有促进牙周组织再生的潜能。DohanEhrenfest等［17］研究结果显示，PRF能诱导牙龈成纤维细胞、真皮前角质细胞、前脂肪细胞和成骨细胞明显而持续的增殖，在培养21d时细胞数可分别达对照组的2～3、1．5～2．5、1．5～3、2～5倍。该研究在分化条件下加入PRF培养成骨细胞，发现PRF同样能促进成骨细胞分化，表现为碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)的高表达和矿化结节的形成，而总DNA/蛋白比值增加说明在分化培养条件下PRF同样能促进增殖。DohanEhren-fest［18］的另一研究同样说明PRF能同时促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化，且作用效果呈剂量依赖性。Gassling等［19］将人骨膜细胞定植于胶原膜BioGide和PRF膜中做细胞培养，结果表明两组中均无死亡细胞;乳酸脱氢酶试验中PRF所得数值约为BioGide的5倍，显示较差的生物相容性;在四唑单钠盐法(WST)检测中，PRF数值高于BioGide，显示出较好的代谢活性;溴脱氧尿嘧啶核苷(bromode-oxyuridine，BrdU)试验中BioGide和PRF与对照组的比值分别为0．89和1，扫描电镜观察到两种膜表面均被细胞覆盖，表明PRF较BioGide促增殖作用明显。以上研究结果提示PRF可以作为促进细胞再生的支架材料用于骨组织工程。

4PRF动物研究

Lee等［20］在新西兰白兔的右胫骨上将直径为3．0mm的种植体植入3．0mm×5．0mm大小的骨缺损区。实验组在种植体周围的缺损区内加入PRF，而对照组不作处理，8周后处死白兔后发现实验组新骨形成(29．30±7．50)%，而对照组仅为(11．06±8．94)%。实验组的骨－种植体接触比也较对照组高约22%。该研究证实PRF在小的骨缺损区有较好的促进骨形成的作用，提示临床上可将PRF用于拔牙区或小缺损区，以减少这些区域的骨吸收。而Kang等［14］研究证实PRF在大面积鼠颅骨缺损区有明显的促进骨再生的作用。毛晶晶等［21］研究证实PRF能在健康成年杂种犬上颌窦提升术中促进新骨形成，提高新骨质量。在该研究中，相较仅用羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)的对照组，植入HA-PRF复合物的实验组在8周时即已出现明显的新骨形成，12周时HA已大部分降解，大量成熟骨形成，可见较多的骨陷窝和哈弗系统。而Lee等［22］在新西兰白兔的顶骨区制备双侧直径为9mm的圆形缺损，右侧植入酸消化后的丝蛋白和PRF，左侧不作处理，12周后micro-CT示组织矿化度和矿化密度实验组均较对照组高，组织学分析实验组新骨形成较对照组高约10%。该实验证实PRF与丝蛋白联合应用能促进骨形成。这些研究说明PRF有明显的骨诱导作用，在与骨替代材料同时使用时，能加速骨替代材料的降解和缺损区骨组织愈合。

5PRF与PRP的比较

PRP制备时需要2～3次离心［23］，加入氯化钙和牛凝血酶后纤维才开始聚合，形成凝胶状，这种快速聚合模式下形成的网状结构十分坚固［6］，不利于细胞因子的捕获和细胞的定植。PRF制备时无需加入任何添加剂，减少了PRF应用时潜在的免疫源性和疾病传播的危险。PRF在一次离心的过程中，自然而缓慢的聚合成凝胶状，所形成的纤维结构较灵活、弹性好，更易于捕获细胞因子［6，9］。而且PRF通过纱布挤压即可成膜，制备时间短，使用方便，价格低廉。PRF与PRP的主要成分都是富集的血小板和纤维蛋白原，富有血小板内的α颗粒中所含的多种生长因子。PRF含有血液中几乎所有的纤维蛋白原［12］，而PRP中纤维蛋白的含量仅为2．5mg/ml［24］。因此，PRF较PRP含有更多的纤维蛋白原。Kang等［14］研究中比较PRF释出液和PRP中生长因子与血管生成相关蛋白的含量，结果发现PRF中血管生成素(angiogenin)、胰岛素样生长因子结合蛋白-2(insulinlikegrowthfactorbindingprotein-2，IG-FBP-2)、胰岛素样生长因子结合蛋白-3、基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1(SerpinE1)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissueinhibitorofmetalloproteinase-1，TIMP-1)、可溶性细胞间粘附分子-1(solubleintercellularadhesionmolecule-1，sICAM-1)、巨噬细胞移动抑制因子(macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF)和受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(regulateduponactivationnormalTcellexpressedandsecreted，RANTES)高表达，而且MMP-9和SerpinE1是PRF中所特有的。其中MMP-9能促进细胞迁移，是人类牙槽骨骨髓干细胞的矿化的关键因素。肉眼观PRF为光滑的淡黄色半透明固体、果冻样，质韧有弹性;PRP为粘稠的红色液体;凝胶状的PRP质地松软，易于与骨粉等物质混合。扫描电镜观察新鲜PRF纤维形成疏松多孔的网状结构［14，25］，血小板聚集在纤维中央，其间有纤维穿行，周围有许多血细胞，如红细胞和白细胞。血小板内α颗粒大部分完整，部分与纤维紧密接触的血小板膜消失，形成紧密接触。PRP血小板聚集成簇，周围散在白细胞。Pretorius等［24］用扫描电镜观察凝胶状新鲜的PRP时发现PRP中细纤维稀疏的分布于粗纤维之间，血小板则以单一实体或聚集体存在。本课题组前期实验研究结果(待发表)表明，PRP纤维短小、密集、直径约90nm，纤维间孔隙直径约0．5～1．1μm，似蜂窝状;而PRF纤维粗大、疏松，直径约160nm，孔隙直径约2～4μm，交织成网状。这些研究结果提示PRF可作为血细胞和生长因子的储库，能通过捕获在纤维网格中的细胞和血小板，长时间的释放生长因子。因而，相较于PRP，PRF更适合作为一种新的生物膜用于组织再生。

6PRF口腔临床研究

6．1上颌窦提升

同种异体冻干移植骨(freeze-driedboneal-lograft，FDBA)作为移植材料用于上颌窦提升术时需要8个月的愈合时间，而有研究表明同时加入PRF时，愈合时间可减至4个月，证实PRF有明显的促进骨形成的作用;该研究还发现上颌窦粘膜穿孔后直接用PRF覆盖，并不影响最终的骨愈合，说明PRF用于上颌窦提升术时可防治上颌窦穿孔［26］。Antoine等［27］在20例病人中共植入35例种植体，种植体植入前，仅用PRF作为移植材料，填充提升的窦底，6～12周后安装愈合基桩，制作种植体;根尖片显示1年后窦底骨高度增加(平均约为3．2mm)，可见新生骨与窦底间有明显的界限，尽管新生的骨量有限，但种植体成功率高达97．1%，仅一例种植体在安装愈合基桩时脱落，该研究表明PRF对上颌窦底扩增移植后的骨再生有明显的促进作用，且安全性高。

6．2上颌骨重建

Simonpieri等［28］将PRF和FDBA混合后溶入0．5%甲硝唑中用于种植术前上颌骨的重建，结果显示:术后3d拆线，切口愈合良好，10周后种植前CT示移植材料形成整体，移植骨和剩余牙槽骨壁间放射学上完全同质。而随后使用该重建技术的20个病人184例种植术的临床研究发现，应用该技术无失败病例，而且可观察到PRF特别有利于骨膜愈合和成熟，具有更好的美学效果［29］。Choukroun［30］报道在上颌囊肿切除术中，切除囊肿后在遗留腔隙中加入PRF，能使空腔的生理愈合时间从6～12个月(平均10个月)显著减少到2个半月。这些临床研究结果证实，PRF具有促进移植骨成熟、提高新骨质量和加速骨生成的作用。

6．3牙周骨缺损

Sharma等［31］比较56例牙周炎骨内缺损病人，实验组联合应用翻瓣术和PRF，对照组仅用翻瓣术，结果表明:术后9个月实验组探诊深度比对照组低约1．3mm，放射线片示牙周附着水平较对照组高0．8mm左右，且实验组缺损区平均骨填充量显著高于对照组。该研究表明PRF能显著促进牙周骨缺损的愈合，但仍需要长期、多因素随机临床对照试验以进一步证实该研究结果。

6．4牙龈退缩

牙周炎病人常伴牙龈退缩，由于病人对美观的要求越来越高，牙龈退缩已成为重要的治疗问题。Anilkumar等［32］报道一例左下颌切牙牙龈退缩接近膜龈联合的病例，在对该病人进行常规牙周机械治疗后，将PRF覆盖于暴露根面，再用侧向复位瓣进行悬吊缝合;术后1个月随访发现无术后并发症，6个月后根面得以完全覆盖，移植组织形态及颜色均极佳。该研究为临床提供了一种新的治疗牙龈退缩的方法。Jankovic等［33］研究比较PRF和釉基质衍生物(enamelmatrixderivative，EMD)与冠向推进瓣联合应用治疗牙龈退缩，结果显示两者效果无明显差异，12个月后PRF组牙龈退缩减少约3mm，角化龈宽度增加，疼痛较EMD组轻。这一研究表明PRF能促进软组织愈合，减轻炎症反应。

7问题和展望

PRF这种纤维蛋白现已广泛用于口腔医学，并取得了良好的治疗效果。其富含白细胞，是一种免疫浓聚物，并且含有多种含量接近而作用拮抗的细胞因子，因而PRF的作用机制复杂，有待更深层次的研究。另外，PRF在俘获细胞和促进细胞增殖分化方面具有特别优异的作用，而且制备简单、成本低、操作性能良好。因此，PRF在口腔组织工程上具有广阔的应用前景。