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先天免疫系统能快速识别并清除入侵机体的病原微生物,是机体免疫防御的第一道防线。在先天免疫应答中,免疫细胞对胞内感染的病原微生物及其产物的快速识别依赖于胞浆内存在的一类多蛋白复合体,称为“炎症复合体”[1]。在组装炎症复合体的多种蛋白质成分中,核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotidebindingoligomerizationdomain,NOD)样受体(NODlikereceptors,NLRs)家族成员,包括NALPs(NACHT,LRRandPYDdomains-containingproteins)、白细胞介素转化酶(interleukin-convertingenzyme,ICE)激活因子(ICEprotease-activatingfactor,IPAF)等,通过识别胞内病原微生物及其产物,并感知来自宿主自身的危险信号而激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteinylaspartate-specificprotease,caspase)-1、caspase-5,调控IL-1β、IL-18、IL-33等致炎细胞因子的合成、分泌和细胞凋亡,参与免疫应答和炎症反应。自Martinon等[2](2002)首次报道以来,迄今已鉴定出4种炎症复合体,根据其核心成分NLRs不同,分别命名为NALP1、NALP2、NALP3和IPAF炎症复合体。目前口腔领域中主要集中于对NALP3炎症复合体的研究。本文现就NALP3炎症复合体的生物学功能及其在口腔领域的研究进展作一综述。
1NALP3炎症复合体的结构和功能
人类NALP3炎症复合体由NALP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingacaspaserecruitmentdomain,ASC)、caspase-1和CARDINAL(接头蛋白)等4种蛋白质构成,主要参与IL-1β、IL-18等致炎因子介导的免疫炎症反应。
1.1NALP3的结构、功能和分布在先天免疫系统中,免疫细胞通过模式识别受体(patternrecognitionreceptors,PRRs)直接识别广泛存在于病原体上的病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs),同时可感知来自宿主自身的危险信号,即危险相关分子模式(danger-associatedmolecularpatterns,DAMPs),引发受体配体反应,启动有效的免疫应答。PRRs主要包括被称为Toll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)的膜结合受体和被称为NLRs的胞浆内受体,两者的区别是,TLRs负责胞外识别;NLRs主要负责识别胞浆内的PAMPs及DAMPs。目前,人类NLRs家族约有23个成员,分为5个亚家族,包括NALPs、NOD、IPAF、MHCⅡ类分子反式激活因子(classⅡtransactivator,CⅡTA)和神经元凋亡抑制蛋白(neuronalapoptosisinhibitorprotein,NAIP)。胞浆内受体NALP3(又称NLRP3)作为NALP亚家族成员之一,起始NALP3炎症复合体的组装,是构成NALP3炎症复合体的核心成分。人类NALP3基因定位于1号染色体长臂4区4带(1q44),全长3.1kb,其基因编码一个含有1036个氨基酸残基、相对分子质量约为1.2×105的蛋白质。NALP3是一个具有复结构域的蛋白,包括3个特征性结构域:①羧基端的亮氨酸重复序列(leucinerichrepeats,LRRs),主要负责识别配体,包括病原体PAMPs和宿主DAMPs;②位于中央的NACHT(NAIP,CⅡTA,HET-EandTP1),是NALP3的核心部分,对于NALP3的寡聚化和活化至关重要;③氨基端的PYD(pyrindomain),通过同型募集PYD-PYD相互作用结合下游效应分子ASC,在NALP3的下游信号传导中发挥关键作用(图1)[3]。目前已知,NALP3表达于外周血的淋巴细胞、粒细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞;高表达于成骨细胞[4]以及复层上皮细胞,包括黏膜非角化鳞状上皮细胞(口腔、食道、子宫颈和阴道部)和移行上皮细胞(膀胱和输尿管)[5]。NALP3这种仅在复层上皮表达的局限性组织分布特征,提示其可能在机体抵御病原体侵袭的第一道防线中发挥关键作用。
1.2ASC、caspase-1、CARDINAL的结构和功能
ASC,作为胞内一种重要的接头蛋白,由氨基端的PYD和羧基端的caspase募集域(caspasere-cruitmentdomain,CARD)组成。ASC通过PYD-PYD相互作用与NALP3结合,并通过同型募集CARD-CARD相互作用与caspase-1前体结合,将病原体识别转化为下游的信号传导。caspase-1包括一个CARD和一个催化区域,后者可将IL-1β前体转化为IL-1β。如前所述,无活性的caspase-1前体与NALP3间接结合,引发自身催化反应,形成具有酶活性的caspase-1。活化的caspase-1将IL-1β前体转化为IL-1β。实际上,IL-1β炎症反应的限速步骤正是caspase-1的活化[6]。CARDINAL,作为胞内另一种接头蛋白,由FⅡND(functiontofind)和羧基端的CARD组成,参与NALP3炎症复合体的寡聚化及caspase-1的活化。
2NALP3炎症复合体的活化信号机制
众所周知,IL-1β是炎性致病机制的决定因子,在免疫炎症反应中发挥核心作用。以无活性形式合成的IL-1β前体必须经caspase-1剪切才能形成有活性的成熟IL-1β分泌到胞外,介导炎症反应。caspase-1的活化是启动IL-1β合成和分泌的关键步骤,而caspase-1的活化又受NALP3炎症复合体的精密调控。因此,严密调节NALP3炎症复合体的活化对调控IL-1β的合成和分泌意义重大。当外界病原体PAMPs和宿主DAMPs被NALP3的LRRs识别并结合后,使处于自我抑制、无活性的NALP3发生结构变化,暴露出NACHT,形成活化的NALP3寡聚体;随后,ASC依次通过PYD-PYD和CARD-CARD相互作用,“承上启下”地将NALP3与pro-caspase-1间接结合,通过自身催化将caspase-1激活;活化的caspase-1将pro-IL-1β在116位天冬氨酸处裂解,形成成熟的IL-1β分泌到胞外,引起炎症反应。NALP3炎症复合体可识别多种病原体PAMPs和宿主DAMPs。近年研究证实:NALP3对细菌及其产物【如脂多糖(li-popolysaccharide,LPS)、肽聚糖及其裂解产物胞壁酰二肽】、真菌菌丝、病毒等PAMPs均有反应[7]。不同于其他炎症复合体,NALP3的独特之处在于对宿主DAMPs的识别,包括三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)、尿酸钠、细胞压力(如形成活性氧序列)等[7]。简而言之,PAMPs和DAMPs被LRRs识别后,活化NALP3,结合ASC,激活caspase-1,加工分泌IL-1β,介导炎症反应。
3NALP3炎症复合体与牙周病的关系
牙周病是牙周组织的慢性感染性疾病。如今,已清楚认识到牙周病的大多数组织损害是宿主对病原体感染的免疫应答。体内研究已证实IL-1是牙周炎病理发生的关键分子[8]。已知,IL-1β的成熟和分泌受caspase-1调控,而caspase-1的调控又与NALP3炎症复合体密切相关,因此NALP3炎症复合体对牙周病的发生发展和治疗具有重要意义。在牙周炎症进程中,牙龈上皮细胞(gingivalepithelialcell,GEC)是牙周宿主防御机制的第一道天然屏障。NALP3炎症复合体功能性表达于GEC,诱导产生IL-1β,在牙周先天免疫应答中发挥重要作用[9]。作为目前公认的牙周致病菌的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)感染GEC后诱导IL-1β基因的转录和IL-1β前体蛋白的胞内聚集,但IL-1β蛋白并未分泌到胞外;用ATP处理GEC后发现IL-1β被分泌到胞外,且不受Pg影响;进一步通过小干扰RNA(smallinterfer-ingRNA,siRNA)敲除NALP3后发现ATP诱导GEC分泌IL-1β的能力有所减弱[9]。ATP从感染、濒死、被压细胞中释放出来,与毗邻细胞的“危险信号受体”相互作用,诱导宿主反应。已发现一种被称为“P2X7”的胞外ATP受体在GEC细胞膜上功能性表达[10]。P2X7受体与胞外ATP结合后,不仅允许阳离子流动,还可从胞内排出IL-1β等代谢产物。研究表明[11]:胞外ATP刺激P2X7受体引起胞内钾离子水平的突然降低是NALP3炎症复合体激活的重要机制。因此,GEC的胞浆内受体NALP3通过识别胞外ATP(DAMP),启动NALP3炎症复合体,活化caspase-1,诱导IL-1β的成熟和分泌,进而介导牙周炎症反应;但ATP与P2X7受体结合后诱导IL-1β分泌的确切机制有待进一步研究证实。此外,胞外ATP与P2X7受体结合后诱导GEC发生细胞凋亡[11],NALP3炎症复合体是否参与其中并发挥作用亦有待研究证实。单核-巨噬细胞作为牙周宿主防御机制的重要组成部分,在动员宿主的抗菌防御中亦发挥重要作用。体外将Pg培养上清液与人单核细胞共培养后发现:NALP3、IL-1β、IL-18基因表达上调,ASC基因表达下降[12]。这与Taxman等用Pg活菌感染THP1单核细胞的研究结果相一致[13]。ASC是炎症复合体的核心成分,当有ASC抗体或ASC非活化形式占优势时,caspase-1活化和IL-1β成熟即被阻断[14]。因此推断ASC表达下降可能抑制单核细胞中NALP3炎症复合体的激活,进而抑制IL-1β的成熟和分泌;Pg可能通过此途径潜在控制牙周宿主免疫反应,使自身有利于在感染的牙周组织中存活。在先天免疫应答中,细胞因子的释放先于细胞死亡。细胞因子释放是早期免疫反应,而细胞死亡是大量细菌侵入后的晚期反应。高浓度Pg及其LPS可诱导人单核-巨噬细胞发生坏死样细胞死亡;且这一过程与NALP3和ASC有关,与caspase-1和IL-1β无关[15]。由于caspase-1是启动IL-1β活化的关键步骤,因此提示NALP3介导的炎症复合体活化与细胞死亡机制可能不同。病原体Pg诱导单核-巨噬细胞的坏死样细胞死亡可能成为一种新的免疫激活方式。在细胞坏死过程中,单核-巨噬细胞除释放大量致炎因子外,其释放的内容物亦向宿主免疫系统发出病原体入侵的级联危险信号。值得一提的是:Huang等[15]首次观察到在Pg诱导细胞死亡的同时伴有ASC聚合物的形成;进一步将转染NALP3突变基因R260W的单核细胞用Pg感染后,发现ASC聚合物的形成显著增加,提示Pg诱导ASC聚合物的形成是依赖于NALP3的。因此,NALP3和ASC在Pg诱导IL-1β释放、ASC聚合物形成和细胞死亡中发挥关键性作用。ASC聚合物作为一个分子平台,促进病原体诱导宿主细胞死亡。深入研究ASC聚合物,将有助于阐明病原体诱导牙周病的发病机制,并为牙周干预治疗提供潜在靶点。IL-1β除主要由激活的单核-巨噬细胞或淋巴细胞产生外,还可由成纤维细胞等释放。体外将龈上、龈下菌斑培养上清液与人牙龈成纤维细胞(humangingivalfibroblast,HGF)共培养后,发现[16]龈上菌斑诱导NALP3炎症复合体及其终末效应分子IL-1β的基因转录增加,分析可能与牙周病的早期炎症有关;而高浓度龈下菌斑刺激HGF后NALP3、ASC、caspase-1和IL-1β基因表达均显著下调,推测龈下菌斑可能通过抑制NALP3炎症复合体信号通路,减少IL-1β等致炎因子生成,抑制牙周宿主免疫反应,从而有利于病原体在牙周组织中的存活。此外,有研究发现:NALP3炎症复合体突变可引起严重的自身炎症性疾病,如类风湿性关节炎、克罗恩病、Muckle-Wells综合征等,且NALP3的多点位点集中在高度保守的NACHT区[17]。目前,有关NALP3突变在牙周领域的研究工作尚未开展,但已观察到IL-1β单核苷酸多态性与牙周病之间的相关性[18]。未来将深入研究NALP3突变与IL-1β多态性之间的相互作用。NALP3突变有望成为识别牙周炎宿主易感性的遗传标志。
4NALP3炎症复合体与白色念珠菌感染的关系
白色念珠菌(Candidaalbicans,Ca)作为一种常见的条件致病菌,是口腔念珠菌病的主要致病因素,IL-1β在宿主抗真菌免疫中发挥重要作用。研究证实[19-20]:NALP3能识别Ca,启动NALP3炎症复合体活化,诱导IL-1β加工分泌。静脉注射Ca后,NALP3(-/-)鼠的肝、脾、肾中真菌量较对照组增加10~100倍[19],提示NALP3缺陷可增强宿主对Ca的易感性。采用Ca持续感染口腔黏膜的鼠模型,发现NALP3炎症复合体能阻止黏膜感染扩散,提高宿主鼠的生存率[20]。进一步研究证实:Ca从芽生孢子形式转变为假菌丝形式,对于激活NALP3炎症复合体是至关重要的;Ca突变体不能形成菌丝样结构,因此无法激活NALP3炎症复合体[19]。由此可见,NALP3炎症复合体的活化取决于Ca形成假菌丝的能力。因此,NALP3炎症复合体可能在宿主抗真菌Ca的先天免疫防御中发挥积极作用。Ca假菌丝作为NALP3的PAMP,激活炎症复合体,诱导IL-1β的加工分泌;并进一步强调了Ca在宿主免疫防御中表型可塑性的重要意义。
5NALP3炎症复合体与肿瘤的关系
研究已证实IL-1β与肿瘤的生长和转移有关。黑色素瘤可分泌IL-1β,在其生长晚期,黑色素瘤细胞通过激活NALP3炎症复合体自发分泌IL-1β,表现出自身炎症性疾病的特征[21]。由于肿瘤源性IL-1β与肿瘤生长、免疫抑制和化学抵抗有关,因此NALP3炎症复合体的活化预示疾病预后不良。另外,通过抑制caspase-1或使用针对ASC的siR-NA,可减少黑色素瘤自发分泌IL-1β[21],提示抑制NALP3炎症复合体信号通路有望成为治疗黑色素瘤的方法。在先天免疫系统中,自然杀伤(naturalkiller,NK)细胞和巨噬细胞是重要的抗肿瘤效应细胞,能介导肿瘤的细胞毒性反应。新近研究证实:炎症复合体的活化对机体获得性免疫亦具有重要调控作用。将抗黑色素瘤细胞的树突状细胞疫苗接种于NALP3(-/-)鼠,结果发现免疫后鼠的生存率较对照组升高4倍[22]。疫苗效能的增强与树突状细胞无关,而与髓源性抑制细胞(myeloid-de-rivedsuppressorcells,MDSCs)有关。MDSCs可抑制机体的获得性免疫和天然抗肿瘤免疫,促进肿瘤发展。研究证实[22]:MDSCs表达NALP3,NALP3缺陷引起宿主鼠体内肿瘤相关MDSCs数量减少5倍。据此推断,NALP3在促进肿瘤MDSCs聚集和抑制抗肿瘤T细胞免疫方面发挥重要作用。因此,NALP3炎症复合体可能在抗肿瘤的先天免疫与获得性免疫中发挥不同的调控作用。未来有望通过抑制NALP3信号通路来增强机体抗肿瘤的免疫反应。
6结束语
综上所述,NALP3炎症复合体在口腔医学领域的研究刚刚起步,虽已初步明确了nalp3炎症复合体参与IL-1β等致炎因子介导的免疫炎症反应,在牙周抗菌免疫、黏膜抗真菌免疫、抗肿瘤免疫中发挥重要作用,但依然存在大量研究空白,诸如NALP3对配体(PAMPs和DAMPs)的具体识别机制、NALP3炎症复合体组装和活化的调控因素、NALP3炎症复合体与其他PRRs(如TLRs、NOD等)的相互作用及其在相关口腔疾病中的作用机制等。这些研究的深入开展将有助于阐明NALP3炎症复合体相关口腔疾病的发病机制,并为拓展口腔疾病诊治的新干预手段提供新的思路。