航空微重力生物学探析范文

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作者：杨肖孙联文樊瑜波单位：北京航空航天大学生物与医学工程学院生物力学与力生物学教育部重点实验室

骨组织中的骨细胞是体内负责感应力学负荷的主要细胞，对机械应力的变化要比骨组织中其它细胞(如成骨细胞)更为敏感。正常重力环境下，当机械力作用于骨时会产生骨应变，引起骨基质变形并挤压骨陷窝，骨细胞可直接感受骨应变产生的液体流动并间接受骨基质的挤压作用，进而激活力学传导通路，将力学刺激转换为生化信号传递给成骨细胞和破骨细胞，使其做出相应反应，通过调控骨形成和骨吸收以调节骨的力学适应性。关于骨细胞力生物学方面研究的文献报道始于20世纪90年代。早期研究一般使用的是原代培养的骨细胞，由于原代培养骨细胞的技术比较难，所以对骨细胞的研究十分有限。直到1999年Linda等从小鼠长骨分离出骨细胞，建立起骨样细胞系MLO-Y4，此后骨细胞力生物学方面的研究才逐渐增多。然而，微重力和超重力环境下有关骨细胞对力学刺激的生物学响应方面的研究仍十分有限。本文主要综述了正常重力下骨细胞对力学刺激下的生物学响应，以及骨细胞加载力学刺激后对成骨细胞和破骨细胞的调控作用，同时对微重力和超重环境下骨细胞力生物学方面的研究进展也作了回顾和总结。

1正常重力对骨细胞的作用

1．1骨细胞对力学刺激的响应

体外培养骨细胞并施加力学刺激，可产生一系列基因和分子代谢水平变化。骨细胞在力学刺激下，一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、三磷酸腺苷(ATP)等信号分子释放量显著增多，Ca2+通道打开、胞外Ca2+涌入胞内，胰岛素样生长因子(IGF)-1、前列环素(PGI)-2等细胞因子改变，基因cox-2、c-fos表达升高，I型胶原、骨钙素(BGP)、骨桥蛋白(OPN)等蛋白表达升高，Wnt/β-catenin信号通路和cAMP/PKA通路在力学刺激下分别被激活，Wnt家族Wnt3a，Con-nexin43，CD44等基因上调，Bcl-2/Bax的基因表达上调，表征凋亡的caspase3/7基因表达下调，糖皮质激素和肿瘤坏死因子(TNF)-α对骨细胞的凋亡作用被抑制，进而抑制骨细胞凋亡。

骨细胞对同一力学刺激下的响应随加载时间和载荷大小而变化，响应敏感程度随细胞不同形态或胞体不同区域而变化。Chen等研究表明，循环压应力作用时间增加，某些基因的表达在作用时间变化的同时发生改变，导致骨细胞上调基因数减少，而下调基因数增多，致使骨细胞募集破骨细胞并发出活化信号的能力增强。Nesbitt等研究表明，骨细胞系受拉伸作用后细胞骨架F-actin排列发生解聚，这种解聚的发生随加载循环的次数、频率以及循环间歇刺激次数的增加而加倍，去负荷后重又回到原始水平。Ratha等发现，MLO-Y4受流体剪切力作用后其胞内钙及NO浓度发生改变，且胞内钙浓度随剪切应力的增加而呈线性增加。Bacabac等发现，半悬浮或悬浮呈球形的骨细胞受力后短时NO释放量增加幅度远高于完全贴壁伸展的骨细胞，且半悬浮或完全悬浮骨细胞受微压力后弹性常数和硬度小于贴壁骨细胞;Vatsa等［20］发现颅骨处骨细胞呈相对球形，腓骨处骨细胞呈细长形，分别对其进行测量后证实，颅骨处球形骨细胞各向异性小于腓骨处细长形骨细胞，两项研究均提示呈球形的骨细胞对力学刺激更为敏感。另外，骨细胞细胞核区域的弹性模量远小于细胞外周，提示核区域对力学刺激更为敏感;而骨细胞突触引起附近钙的瞬变所需的形变远小于细胞体引起钙瞬变所需的形变，提示骨细胞突触比骨细胞体对力学刺激更为敏感。骨细胞对不同方式的力学刺激的响应也不同。Ponik等对MLO-Y4分别施加脉动和单向剪切力，发现骨细胞受单向剪切力24h后F-actin呈现线性排布，而脉动剪切力作用24h后F-actin则伸展出多个突触，其形态与骨细胞突触的形态类似。Miyauchi等发现，循环拉应力下骨细胞的胞内钙明显增加，胞外钙大量涌入胞内，IGF-1mRNA表达明显升高。但Teruko和Kamioka等［23-24］的研究表明，骨细胞受剪切应力作用后并未产生胞内钙的瞬时变化响应。Jiang等发现，MLO-Y4受恒定剪切应力刺激后，Cx43表达上调使得由Cx43组成的间隙连接被激活，进而诱导胞内PGE2的释放。而Genetos等发现，MLO-Y4受脉动剪切应力作用后，虽然Cx43蛋白组成的间隙连接被激活，但并不直接诱导PGE2的释放，而是诱导ATP的释放增加。

常用的对骨细胞施力形式主要包括牵拉力、压应力和剪切力，而近年有学者利用原子力显微镜、光镊、显微操作针等新兴力加载方式对骨细胞施力，测量其形态及弹性模量、硬度、各向异性等力学参数的变化。例如Sugawara等用原子力显微镜测量出成骨细胞、类骨细胞及骨细胞3种细胞的弹性模量，发现从成骨细胞向骨细胞转化的3个阶段细胞的弹性模量成比例下降，且骨细胞黏着斑附近弹性模量远低于成骨细胞相同区域的弹性模量，提示骨细胞受到力学刺激后更易变形，间接反映骨细胞对力学刺激更为敏感的特性。

1．2力学刺激下骨细胞对成骨和破骨细胞的调控作用

骨细胞在响应力学信号时释放的PGE2，NO，ATP，可溶性破骨细胞分化因子(sRANKL)，护骨素(OPG)等均是调节成骨细胞和破骨细胞活动的潜在因素。骨可承受的生理应变范围在1200～1900με，相应的骨细胞可承受的剪切应力作用范围在0．6～3Pa(1Pa=10dyn/cm2)，低于体内正常应力范围的力学刺激会诱导骨细胞释放PGE2等保护破骨细胞的信号分子，使OPG-L/ODF的mRNA水平升高，募集破骨细胞到应力作用低的部位，促进破骨细胞分化及活性，并增强骨吸收。而体内正常受力范围内的力学刺激下，骨细胞释放的PGE2下降而NO释放量增加，抑制sRANKL/OPG释放，驱散破骨细胞或抑制破骨细胞形成，阻止骨吸收的发生，同时增强成骨细胞活性，促进成骨作用。力学刺激后的骨细胞通过与成骨细胞的间隙连接或释放信号分子至培养基内，增强成骨细胞的活性。Taylor等研究表明，共培养骨细胞和成骨细胞时，对骨细胞施加4．4dyn/cm2的恒定低剪切应力1h，骨细胞会通过细胞间隙连接向成骨细胞释放Ca2+，使成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性增强，而用受剪切骨细胞的培养基培养成骨细胞2h，成骨细胞的ALP活性未见显著增强。然而，Peter等发现，用7dyn/cm2，5Hz的脉动剪切应力作用骨细胞1h后的培养基培养成骨细胞48h，ALP活性明显升高。这可能与不同力学刺激方式及培养成骨细胞的时间长短有关。骨细胞受力学刺激后还可抑制破骨细胞形成及活性。You等发现，将受10dyn/cm2、1Hz的脉动剪切应力作用2h后的骨细胞与破骨前体细胞共培养7d，可抑制前体细胞向破骨细胞分化，此外骨细胞释放于培养基内的sRANKL/OPG下调。Tan等收集了受7dyn/cm2，5Hz的脉动剪切力1h的骨细胞培养基，用于培养破骨细胞6d，显著抑制了破骨细胞的形成，进而阻碍骨吸收的发生。Lau等则利用低幅(0．3×g)高频(30～90Hz)振动作用于骨细胞1h后的培养基培养破骨前体细胞5d，同样抑制破骨前体细胞向破骨细胞的分化，同时骨细胞内的RANKL/OPG基因下调。受力后的骨细胞功能蛋白的表达也会发生变化，从而影响成骨和破骨。sclerostin是骨细胞特异性蛋白，为Sost基因的产物，与DDK1同是影响骨形成的蛋白，sclerostin和DDK1均可通过抑制Wnt信号通路阻碍骨形成的发生;压缩小鼠尺骨后发现Sost基因转录、sclerostin及DDK1蛋白表达均下降，提示Wnt/Lrp5信号通路可能被激活。另外，HB-GAM也是一种骨细胞特异性蛋白，在骨细胞受剪切应力作用时上调，其表达参与力学刺激引起的成骨作用，但可能与骨吸收作用无关。

2微重力对骨细胞的影响

空间飞行为骨细胞力生物学研究提供了真实的微重力环境。Bacabac等在空间飞行实验中搭载原代培养的骨细胞，并在飞行过程中对其施加脉动剪切应力，发现相关地面实验组骨细胞受两次剪切应力刺激后NO释放量显著增加，但由于硬件原因并没有获得有效的空间实验组数据。Rodionova等发现，空间飞行搭载的猕猴髂骨早期骨细胞内，合成胶原蛋白的粗面内质网数量明显增多，成骨细胞具有成纤维细胞显型，其周围被胶原纤维包围且未出现骨矿化，骨陷窝形成被抑制;成熟骨细胞内合成溶酶体的高尔基复合体数量及溶酶体数量明显增加，骨细胞溶骨活性增强，骨陷窝内已矿化的骨基质吸收增强。空间飞行的研究费用昂贵，因而地面实验中常用啮齿动物尾吊去负荷模型和细胞回转装置模拟微重力来进行相关研究。Basso等发现大鼠尾吊2周后，骨细胞凋亡率明显上升，破骨细胞数量增加，胫骨骨量降低;重负载后大鼠体内骨细胞数和骨量恢复到正常水平，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)阳性表达的骨细胞较原有水平上升50%，提示重负载可促进骨细胞NO释放量的增加，进而抑制骨细胞凋亡和破骨细胞形成。此外，Aguirre等证实，小鼠尾吊后皮质骨内骨细胞首先发生大量凋亡，进而募集破骨细胞，导致凋亡区域优先发生骨吸收。另一研究表明，小鼠尾吊后，胫骨骨细胞的Sost基因表达明显增加，抑制了Wnt/β-catenin信号通路，影响骨细胞活性及成骨细胞功能，阻碍骨形成;而敲除Sost基因的小鼠尾吊后Wnt/β-catenin信号通路并未被抑制，可有效对抗后肢废用性骨量丢失。孟芮等利用细胞回转器初探骨细胞模拟微重力后其培养基对成骨细胞功能的影响，发现用条件培养基培养的成骨细胞在24h和48h时明显增殖，但OPN，Runx2，BGP，ALP等成骨相关基因表达明显下降。Tatsumi等培育了一种转基因小鼠(Tg小鼠)，其骨细胞可特异表达白喉毒素(DT)受体，注射DT可消除体内70%～80%骨细胞，Tg小鼠与野生型小鼠(WT小鼠)相比，表现出骨老化、骨脆性增加、成骨功能紊乱、骨小梁微结构退化等现象。但尾吊注射DT的Tg小鼠7d却未出现模拟微重力引起WT小鼠的骨丢失现象，提示小鼠对负荷消失的感知需通过骨细胞。然而，如果给Tg小鼠注射DT去除骨细胞的时间后移至恢复负载期，则尾吊引起的骨量丢失2周内即可回升至正常水平，提示破骨和成骨细胞对负载力学刺激的响应可能无需通过骨细胞。

3超重对骨细胞的影响

近年来，Qian等开始利用大梯度高磁场(LG-HMF)构建出的0G重力或2G超重力环境，研究骨细胞形态学和骨架的变化。他们发现骨细胞在0G和2G环境中，细胞形态、胞核尺寸、细胞骨架排布及黏着斑蛋白的分布和表达相较1G对照组均发生变化，且猜测细胞粘附相关的蛋白可能参与了骨细胞感知力学环境的改变。Di等还对进行过抛物线飞行实验的骨细胞其形态、细胞骨架等进行分析。飞行实验在上升过程时产生超重环境加速度达1．8G，持续20s，并在自由下落时产生微重力环境。抛物线飞行实验发现骨细胞的面积和高度没有显著性变化、无细胞凋亡现象，但肌动蛋白在细胞边缘聚合增强，微管被分解且中心消失，Cx43蛋白表达下降，提示微重力与超重力环境的转换导致骨细胞细胞骨架发生改变，并抑制细胞的间隙连接。地面实验模拟空间发射超重环境时，3G的超重环境即可使成骨瘤细胞分裂旺盛、增值迅速并堆叠生长。此外，成骨细胞粘附性发生改变，肌动蛋白纤维数量和厚度增加、粘着斑蛋白数量增加，纤维蛋白荧光强度下降，成骨细胞胶原合成增加，I型胶原CollA2的mRNA表达增加。成骨细胞增殖明显，细胞分化被抑制，PGE2释放量增加。初期成骨细胞对超重的响应相较已分化的成骨细胞敏感，其在10G时释放的PGE2是在正常重力环境下释放量的2．5倍，且释放量随超重加速度以及持续时间的增加而增加。2G的超重环境可促进骨髓间充质干细胞的增殖，细胞内微管及微丝聚合作用加强，胞内ALP，Cbfa1和CollA1基因表达升高，促进其向成骨细胞分化，成骨功能增强。还有研究表明30G的超重环境会导致破骨细胞的活性升高。此外，VanLoon等［53］利用原子力显微镜在超重环境下对成骨细胞施加微压力，发现成骨细胞细胞高度下降，细胞形态和细胞骨架结构发生变化，粘弹性发生改变，以适应力学刺激的变化。

4结语

骨细胞不仅是骨组织内对力学负荷变化最为敏感的细胞，其本身不同区域对力学刺激的敏感性也不同;同时当力学负荷的形式或加载时间发生变化时，骨细胞对其的响应也随之有所改变。目前有关骨细胞正常重力下对力学刺激的响应及其对骨组织内其他细胞调控的研究已有较多的报道。然而，关于微重力下骨细胞力生物学研究还十分有限，微重力环境下骨细胞对力学刺激的生物学响应以及对其它细胞的调控，尤其超重下骨细胞对力学刺激的生物学响应，都有待深入的研究。