游离DNA法医学鉴定论文范文

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1cfDNA的相关研究

1.1cfDNA的存在形式目前发现cfDNA分子大小在0.18～21kb之间［9］，主要以核小体形式存在，也可存在于凋亡小体和微小颗粒(microvesicle，MV)中［3］，这些存在形式可防止其被DNA酶Ⅰ降解。cfDNA的存在形式不仅解释了其稳定存在的机制，且为cfDNA有效收集和提取提供了实验基础。

1.2cfDNA临床应用cfDNA在人体内分布广泛，在临床肿瘤、产前诊断和自身免疫性疾病等方面被广泛研究和应用。Leon等［10］首先报道肿瘤患者外周血中存在较高水平的cfDNA，随后多名学者分别进行了肿瘤与cfD-NA的相关性研究。Roth等［11］通过研究认为外周血cfDNA有可能成为肺癌新的微创诊断指标和风险评估工具。Lee等多名学者研究发现包括肺癌在内多种肿瘤组织细胞DNA与cfDNA存在一致的基因改变，提示外周血cfDNA甲基化与肿瘤性质有良好的相关性，可充当潜在的实时肿瘤标本用于肿瘤治疗监测和预测复发的潜在指标。Fournie等［9］发现小细胞肺癌患者血中cfDNA浓度和神经元特异性烯醇酶活性显著相关后，认为血中cfDNA可能来源于肿瘤细胞。Chiu等［14］报道母血中存在胎儿游离dna，使无创产前诊断成为可能。何小玲等对母血胎儿游离DNA用于无创产前诊断染色体异常疾病的准确性进行系统评价，认为该方法具有高精确性。Leffler等［16］研究表明系统性红斑狼疮患者由于DNA酶Ⅰ活性受损而不能及时降解死亡的中性粒细胞，过多的cfDNA可与蛋白质、脂类等形成复合物并在循环中长时间存在，可能会诱发自身抗体的形成。Li等［4］通过对36例无精子症患者Y染色体微缺失诊断，发现精浆cfDNA和血液白细胞DNA完全一致，认为精浆cfDNA可作为无精子症患者Y染色体微缺失无创诊断的备选途径。

1.3cfDNA的检测技术临床中对cfDNA检测辅助疾病诊治主要基于PCR技术进行疾病相关基因的检测，通过使用预先设计合成的引物对cfDNA进行特异性扩增，根据扩增产物的类型和数量，实现对疾病无创或微创的定性或定量检测(如荧光定量PCR)。放射免疫法因其高灵敏度和高特异度亦是检测cfDNA的简便准确又灵敏可靠的方法，如首次报道肿瘤患者血液中发现cfDNA的Leon等就用的此方法。然而，人体内cfDNA水平受多种因素影响，该指标的改变无法对疾病(如肿瘤)的类型作出特异性的诊断，因此对cfDNA进行检测的同时应结合其它的与疾病相关的标志物水平改变进行联合诊断，可有利于提高疾病诊断的敏感性和特异性。

2cfDNA在法医学中的应用

目前，关于游离mRNA分型用于在分子水平对斑痕类检材来源的分析已有报道，但cfDNA在法医学的应用却少见报道。Diehl等［19］研究表明，游离DN段中只有相对少的片段中存在突变，大部分的DN段为野生型，Wu等发现血浆中的cfDNA长度可达21kb，这使得对cfDNA进行PCR-STRs分析存在理论可能性。陈阳等研究发现，同一个体的血浆cfDNA与血细胞DNA的15个STR分型一致，认为血浆cfDNA可作为一种有效的生物样本进行STR分型检测。国外多名学者研究接触类检材DNA多态性时，推测汗液中的cfDNA可能有助于痕量检材的正确分型。Quinones等在80%的健康个体的汗液中检测到了cfDNA，并认为cfDNA与细胞核DNA一样可用于接触类检材DNA分型。Vandewoestyne等研究了多种斑痕和接触类检材中的cfDNA，发现痕量检材分型时无论cfDNA和细胞核内DNA都可能出现等位基因缺失并且类型可能不同，建议将cfDNA和细胞核DNA分别提取并同时分析以保证分型完整与准确。临床医学中建立的cfDNA提取方法相对较多，除常规的有机溶剂法外，还有分离柱洗脱法、磁珠法、第二代测序等多种方法。但在法医学实践中，检材中的cfDNA是极微量的，因此临床中所用的cfD-NA的提取方法并不适用，往往需要改良，以降低检材基因组DNA的损耗与污染。苏恩本等研究孕妇外周血中胎儿cfDNA多态性时，对QIAampBloodMiniKit提取方法进行改良，用同一份DNA洗脱液洗脱多个DNA吸附柱以提高cfDNA的浓度，从而提高了母血中胎儿DNA的检出率。由于cfDNA的分子大小在0.18-21kb且多以直径小于0.22μm复合物形式稳定存在的双链DNA，具有含量少、片段小的特点，因此可使用特定孔径的滤膜或滤管选择性的滤过cfDNA，以便与其它生物大分子分离，提高cfDNA的纯度。Vandewoestyne等使用100K超滤管对斑痕类检材浸液的cfDNA进行滤过富集后成功对多种斑痕类检材cfDNA实现分型。然而，司法实践中在对接触类、斑痕类检材的分型时，作为重要组成部分的cfDNA却往往被丢弃，如采用Chelex-100法提取DNA过程中含有cfDNA的检材浸液在离心后被弃掉。而对痕量检材分型，特别是初次分型失败(无扩增产物或出现等位基因丢失)的检材，通过适当的方法收集并提取cfDNA，可增加检材DNA产量，提高检出率;同时将cfDNA分型与细胞核基因组分型同时进行分析有利于避免因等位基因丢失导致的分型错误，保证分型完整与准确。

3总结与展望

在临床医学中，cfDNA作为重要分子标志物应用广泛，在法医学实践中的应用较少，但因其既可增加DNA产量同时能完善DNA分型，理论上可增加痕量检材分型成功率，有较大潜在应用价值。然而，对cfDNA进行STR分型时仍面临许多问题。健康个体不同组织和体液cfDNA含量差异较大，但总体含量偏少，更何况司法实践中常见的痕量检材，因此须选择如试剂盒等适合痕量检材DNA提取的方法，无疑增加了检测难度和成本。同时，cfDNA往往与蛋白质、脂类等物质结合在一起形成复合物，仅少部分为游离DN断，并不能通过离心简单将cfDNA与细胞核DNA完全分离［24］。同时，肿瘤组织容易出现微卫星不稳定和杂合性丢失导致与正常组织STR分型不一致［27］，而肿瘤患者体内的cfDNA主要来源于肿瘤细胞，并且与肿瘤细胞DNA存在一致的基因改变，因此分析肿瘤患者cfDNA用于法医学应格外慎重。虽然检材中的cfDNA含量很低，但却可能用于基因组DNA分型，为提高痕量检材分型的成功率提供了新的思路。随着DNA提取和分型技术灵敏度的提高，对cfDNA分型并用于司法实践将成为可能，在痕量检材分型实践中将发挥重要作用。

作者：徐冬冬黄花张明阳杜冰王韵单位：川北医学院法医学系四川省南充精神卫生中心南通大学法医系