基因座法医学采集探究范文

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作者：姜先华贾菲赵金玲沈红缨陈初光金萍郭飞李秋阳邵武于蛟单位：辽宁省刑事科学技术研究所基点认知技术有限公司中国医科大学法医学院

复合扩增体系的建立和优化

建立20个基因座的复合扩增体系，并进行调整、优化实验:引物浓度设置梯度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35μmol/L)。引物退火温度设置梯度(56、57、58、59、60、61、62℃)。缓冲液浓度设置梯度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35μmol/L)。

模板浓度以9947A标准品DNA(10ng/μL)为模板，设置梯度(0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5ng)。PCR循环次数在以上确定的最佳引物浓度、退火温度、缓冲液浓度、DNA浓度条件下，设置PCR循环次数梯度(27、28、29、30、31、32)。

PCR产物的检测

采用ABI3130XL型遗传分析仪及GeneMapper3.2软件对PCR产物进行检测和分型。编制与复合扩增体系中的基因座相对应Panel和与等位基因数据项对应Bin，导入GeneMapper3.2软件用于分析判型。

扩增体系指标验证及法医学应用

1扩增体系技术指标验证

一致性368份无关个体血样采用TECAN工作站磁珠法提取DNA，STR分型结果与SinofilerTM和PowerPlex16分型结果进行一致性和成功率比较。灵敏度采用美国Promega公司的9947ADNA(10ng/μL)进行灵敏度检测。模板定量为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625ng进行检测，平行重复3次。种属特异性设置人源性和非人源性检材(猪、鸡、鱼)，测试方法的种属特异性。

2案件检材应用

血斑、混合斑、汗液斑、唾液斑、肋软骨、肌肉组织和毛发样本，经Chelex100法提取DNA，采用本文方法检测，与SinofilerTM和PowerPlex16分型结果比对。

结果与讨论

1检测方法及遗传学调查

本文最终选择的五色荧光复合扩增总体系10μL，内含:模板DNA0.5ng、2.5×PCR缓冲液4μL、5×引物混合物2μL、GoldTaq1U0.2μL。PCR循环参数为:95℃5min;94℃30s、60℃1min、70℃1min，共30次循环;最后60℃延伸30min。电泳检测:取1μLPCR产物、8.5μL去离子甲酰胺、0.5μLORANGE500分子量内标，混匀，95℃变性3min，立即冰浴;使用ABI3130XL型遗传分析仪电泳分离，毛细管36cm，“DyeSet”选择“E5”。采用GeneMapperIDv3.2软件进行分析。结果表明，本方法可对所选20个基因座成功分型，且均衡性良好，峰型对称尖锐、无双肩峰等杂峰。

应用本文方法对368份无关个体血痕样本进行检测，19个STR基因座数据采用直接计数法和PowerStatsV12软件(www．promega．com)进行遗传学统计分析。结果表明:各基因座基因型观察值和期望值之间无显著差异，均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。19个STR基因座的等位基因及其频率以及相关遗传学参数见表2、3。从表2、3可见，除D3S1358、CSF1PO、TPOX、TH014个基因座外均为高杂合度(H＞0.7)、高识别能力(DP＞0.9)和高信息量(PIC＞0.7)基因座。本方法累积个人识别能力为0.999999999999999999999，高于IdentifilerTM和PowerPlex16，累积非父排除率为0.99999999，可为法庭科学DNA分析工作提供更加准确的判断依据，且可做到一次检测获得更多信息，对数据库建设和实际案件有重要意义。

2方法指标验证

一致性368份无关个体血样经该方法检测得到的分型与SinofilerTM和PowerPlex16相同基因座的分型结果完全一致，说明该检测方法具有良好的准确性和一致性。灵敏度经对不同模板量进行检测，最佳模板量为0.125～1.0ng，峰高均值在500～2000Rfu之间。

模板量低至0.0625ng仍可获得完整STR分型结果，但峰值小于100Rfu，亦可出现杂合子峰高不均衡现象。模板量为2.0ng时，峰值达6000Rfu，易出现拔起峰及杂峰，影响结果判读(图1)种属特异性采用本文方法检测猪、鱼、鸡的DNA样品，结果与IdentifilerTM所报道的种属特异性检测结果一致。鱼和鸡样品结果为阴性，猪样品图谱分型区内均无扩增产物，仅在性别位点前出现103bp非特异性扩增峰，但不影响人源DNA判型(图2)。结果表明本文方法具有良好的种属特异性。

3实际案例检材应用

55份案例检材经Chelex100法提取DNA，采用本文方法进行分型检测，与SinofilerTM和PowerPlex16结果进行比对，各基因座均获得一致的分型结果。当检材为低拷贝模板时，可获得的基因座数量更多。例如某案例的甲醛固定石蜡包埋样本，采用本文方法和SinofilerTM使用相同模板量及电泳参数进行检测，本文方法得到10个基因座的分型，而SinofilerTM仅得到7个基因座的分型，且前者平均峰高高于后者(图3)。

综上，本文建立的五色荧光标记复合扩增体系，可对生物检材20个基因座进行检测，其个体识别能力、非父排除能力、检测灵敏度和检材适用性等均可达到当前商品化试剂盒的检测水平，为法医DNA分析检测提供了新方法，并因其可检测到更多基因座，故在提高数据库比对中具有巨大应用潜力。