人白血病细胞K562增殖的作用范文

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白血病是造血系统的恶性肿瘤，其特征是骨髓、淋巴结等造血系统中一种或多种血细胞成分发生恶性增殖，并浸润体内各脏器组织，导致正常造血组织细胞受抑制，产生各种症状。目前，对于此类疾病的治疗主要采取传统的化疗手段，标准的化疗方案仅能使40%~60%患者获得暂时缓解，中位生存期一般不超过3a。大剂量化疗联合造血干细胞移植可使缓解率明显提高，但除了极少数患者以外，其余大部分仍难免会复发，其显著的不良反应使得患者的生活质量和治疗信心受到严重影响。因此，寻找高效低毒的治疗药物，显得尤为重要。我们以k562细胞作为研究对象，探讨力达霉素（LDM）抗白血病的可能机制。

1材料

K562细胞（本室保存）；LDM（由中国医学科学院医药生物技术研究所甄永苏院士惠赠）；RPM-1640（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Biological公司）；MTT（噻唑蓝）法检测细胞增殖及细胞毒性试剂盒（南京凯基）；苔盼蓝；兔抗人肿瘤坏死因子（TNF-α）抗体（美国Affinity公司）；Betaactin（β肌动蛋白）抗体（美国Affinity公司）

2方法

2.1细胞培养K562细胞株从液氮中复苏后，用含10%胎牛血清的RPM-1640培养液在37℃，5%CO2恒温培养箱中培养，所有实验均采用对数生长期细胞。

2.2细胞增殖的检测在96孔板加入细胞100μl/孔（约1×104），置37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24h后，加入不同浓度力达霉素（LDM），再于恒温培养箱孵育48h，加入50μlMTT，37℃孵育4h，使MTT还原为甲臜，1000g离心，吸出上清，每孔加入150μl二甲亚砜（DMSO）使甲臜溶解，平板摇床摇匀，于490nm波长处检测每孔的吸光度（A）值，计算细胞成活率。

2.3细胞的计数离心收集K562细胞，制备单细胞悬液并作适当稀释，细胞悬浮液与台盼蓝溶液以9∶1混合混匀，在3min内分别计数活细胞和死细胞，计算活细胞率。

2.4细胞凋亡形态的观察将K562细胞2×105个/ml浓度接种于含10%的小牛血清的RPMI1640培养基中，置24孔板中，每孔2ml，加入不同浓度的LDM，设对照组，培养48h，转入离心管，1000g离心，弃上清，取0.2ml涂片，冷风吹干，瑞氏染色10min，姬姆萨染液染10min，冲洗，晾干，在倒置显微镜下观察。

2.5细胞培养上清中TNF-α表达的检测将K562细胞置37℃，5%CO2细胞培养箱培养48h后1000×g离心，收集细胞培养上清。采用ELISA试剂盒进行检测。

2.6凋亡相关蛋白的检测离心收集K562细胞，预冷的PBS洗涤2次，加入裂解缓冲液1ml（PMSF10％）震荡混匀，冰浴30min。细胞裂解物在4℃12000g离心5min，取上清。使用BCA（Bicinchoninicacid）蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。等量的蛋白样品进行SDS-PAGE，将电泳分离的蛋白转移到PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）上。室温下用含5%脱脂奶粉［PBS（磷酸缓冲盐溶液）溶解］封闭1h。随后加入一抗（1:500）4℃过夜。PBST（PBS溶液加上吐温-20）洗膜3次，加入相应的二抗，37℃孵育1h，PBST洗膜3次。ECL曝光法显色，通过成像系统捕获图像，并通过图像分析系统对所得区带进行扫描，比较各组的积分A值。

2.7统计学分析实验数据采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，实验结果采用x±s表示。

3结果

3.1LDM对人白血病K562细胞增殖的影响不同浓度LDM素作用K562细胞48h后，置于全自动连续光谱酶标仪在490nm处测定A值。按公式：细胞存活率%=（加药细胞A/对照A）×100，从而得出LDM对K562细胞作用的半数抑制浓度（IC50）为10-10mol/L。

3.2LDM对人白血病K562细胞活性的影响苔盼蓝染色显示，正常细胞无色，死细胞呈蓝色。不同浓度LDM素作用于K562细胞48h后对其生长均有一定的影响。分别用10-12、10-11、10-10、10-9、10-8mol/L浓度的LDM素作用K562细胞。按公式：抑制率（IR）%=死细胞数（/活细胞数+死细胞数）×100，计算出IR值。测得IR值分别为（21.2±2.5）%、（37.5±0.97）%、（5.21±1.2）%、（64.5±1.6）%和（71.3±2.0）%。

3.3LDM对人白血病K562细胞凋亡形态的影响未经药物处理的对照组K562细胞多呈圆形，经不同浓度LDM处理后，均出现明显凋亡形态，包膜皱缩，有泡状突起及不规则凹陷，胞核染色质浓缩，固缩，浓染，断裂成小团块分散在胞膜周边，以至形成凋亡小体。

3.4LDM诱导人白血病K562细胞TNF-α在细胞培养上清中的表达结果显示，10-8、10-10、10-12mol/L的LDM处理后，细胞培养血清中TNF-α的含量分别为16.2±4.0、35.0±2.9、51.0±3.6、60.5±0.5，对照组为（16.2±4.0）pg/ml，3个浓度组与对照组的差异均有统计学意义（P<0.01）。3.5LDM对人白血病K562细胞TNF-α表达的影响用10-8、10-10、10-12mol/L浓度LDM处理组48h后，TNF-α蛋白的表达量依次为0.42±0.01、1.67±0.13（P<0.01）和2.41±0.08（P<0.01），与对照组0.23±0.02相比，A值升高。4讨论目前认为，肿瘤的发生和细胞增殖与细胞凋亡平衡失调有关。细胞凋亡是细胞内源性基因调控下的生理性细胞死亡方式，凋亡过程受阻是肿瘤发生的主要机制之一，同时也是临床上肿瘤治疗研究的热点之一。

诱导凋亡是化疗药物抗白血病的重要机制。LDM（原名C-1027，lilamycin）是具有我国自主知识产权的烯二炔类（enediyne）抗生素，以其抗肿瘤的强烈活性及独特的DNA切割方式而颇受重视。LDM由1个辅基蛋白和1个发色团组成，发色团是其活性部分。LDM能引起核苷酸碱基和序列特异性的DNA单链和双链断裂。大量研究表明，力达霉素具有较强的抗肿瘤活性，LDM能够强烈抑制肿瘤生长和肿瘤转移。最近有研究证明，LDM可以诱导肿瘤细胞染色体异常和端粒错排。以往研究显示，不同剂量LDM能诱导多种类型的肿瘤细胞死亡，如典型细胞凋亡，但其究竟确切作用于哪种凋亡通路目前尚不清楚。细胞凋亡是一种在基因控制下的细胞主动死亡过程，以核酸内切酶活化后将DNA分解为180bp整倍数的片断DNA为特征。形态学上表现为细胞起泡，核固缩。LDM作用非常迅速，活性比一般抗肿瘤药强。要抑制肿瘤细胞的生长，一方面可以通过影响细胞周期，使其不能进行正常的有丝分裂；另一方面可以促进细胞凋亡，以达到治疗目的。本研究采用MTT法观察了LDM对人白血病K562细胞增殖有抑制作用，其IC50值为10-10mol/L，作用均强于丝裂霉素和阿霉素，显示出LDM对K562细胞有极强的杀伤作用。人白血病K562细胞经LDM处理后，细胞均出现明显凋亡形态，胞膜皱缩，胞核固缩，浓染，断裂成小团块分散在胞膜周边，以致形成凋亡小体。细胞凋亡是内外多因子复杂的相互作用诱导产生凋亡信号，目前普遍认为是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶（caspase）在凋亡不同阶段发挥作用，分为调控性caspase和效应性caspase形成凋亡信号转导的酶级联反应。TNF-α是一种具有广泛生物学效应的细胞因子，因其可致肿瘤出血，并能抑制、杀伤体外培养的肿瘤细胞而得名。TNF-α的生物学活性占TNF总活性的70%～95%，其前体由223个氨基酸组成，相对分子质量为26，成熟的TNF-α含157个氨基酸，无蛋氨酸残基，即无糖基化位点，TNF-α通过细胞膜上的受体（TNFR）发挥生物学活性。TNF的生物效应都是通过细胞表面的2种TNF受体（TNFR）引发，其信号转导通路主要包括caspase家族介导的细胞凋亡、衔接蛋白TRAF介导的转录因子NF-B和JNK蛋白激酶的活化。

细胞凋亡的死亡受体途径是指细胞凋亡由死亡受体［主要有Fas（factorassociatedsuicide）、TNFR（tumornecrosisfactorreceptor）家族和TGF-βR（transforminggrowthfactorβreceptor）等］介导，与各自的配体相互结合后激活下游的信号转导。其中Fas和配体FasL（Fasligand）结合，通过死亡功能区活化接头蛋白FADD（Fas-associatedproteinwithdeathdomain），而FADD又可以通过N端的死亡效应域DED（Deatheffectordomain）和Caspase-8相互作用引发细胞凋亡。本实验研究证实，低浓度LDM可能通过上调TNF-α表达水平诱导K562细胞凋亡抑制其增殖，其作用机制有待进一步深入研究。

作者：穆丹 张志斌 章广玲 刘志勇 陈静 单位：河北联合大学 生命科学学院 基础医学院 河北联合大学附属医院