白血病的DKK1基因研究范文

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白血病是一种造血干细胞恶性克隆性疾病，与表观遗传学的改变密切相关，其中关于DNA甲基化为当今研究热点之一。由于大量研究表明白血病的发生与dkk1基因甲基化状态有密切关系，因此我们就DKK1甲基化与白血病的研究进行了综述。DKK1基因与Wnt/β-catenin信号通路Dickkopf-1(DKK1)是Glinka等首次在两栖动物非洲蟾蜍胚胎细胞中发现的一种分泌型糖蛋白，属于DKKs家族成员。人类的DKK1基因位于10q11，含有2个富含半胱氨酸的保守区域Cys1和Cys2，由266个氨基酸组成，其相对分子质量在29kDa左右，N端经糖基化修饰后其相对分子质量在35kDa左右，目前确认的结合受体有低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP-5与LRP-6)和跨膜蛋白(Kremen)受体两类。研究揭示DKK1基因启动子区域甲基化改变与多种疾病的发生发展及预后有关，如乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肾细胞癌、多发性骨髓瘤、白血病等。所谓基因甲基化是指DNA复制后，在DNA甲基化转移酶(DNMT)的介导下，催化腺苷甲硫氨酸的甲基转移到DNA分子中形成5-甲基胞嘧啶，从而生成甲基化的DNA。DKK1基因正常情况下其启动子区域CpG岛是处于非甲基化状态的，一旦该区域出现了高甲基化，就会导致DKK1基因转录沉默。

大量研究表明，通过与Wnt信号通路上相应的受体结合，DKK1对细胞的分化、增殖、迁移或癌变等特性进行调控，在肿瘤发生方面发挥重要作用。Wnt/β-catenin信号通路参与胚胎发育及肿瘤形成，同时与造血系统发育、造血干细胞自我更新及某些恶性血液病密切相关。当细胞分泌的Wnt蛋白与细胞跨膜受体卷曲蛋白(Frizzled)结合后，在辅助受体LRP-5/LRP-6的协同作用下，激活细胞内的信号转导，使胞质内散乱蛋白(dishevelled)发生磷酸化而活化。磷酸化的散乱蛋白抑制了GSK-3β的活性，使β-catenin不能与Axin-APC-GSK-3β等形成降解复合物，从而使胞浆内游离的β-catenin蛋白积聚，进入细胞核，与淋巴增强因子(lymphoid-en-hancingfactor，LEF)/T细胞因子(T-cellfactor，TCF)结合，形成β-catenin/TCF/LEF转录复合体，使下游靶基因如C-MYC、cyclinD1等转录和表达增高(附图)，最终促进肿瘤的发生。Mao等发现，DKK1作用通路是通过竞争Wnt蛋白结合LRP5/6受体而直接抑制Wnt蛋白活性，或通过含kringle结构域的Kremen受体间接与LRP5/6受体结合，从而形成三聚体复合物，降低Wnt蛋白向细胞内传导信号，阻断经典Wnt/β-catenin/TCF传导通路，抑制肿瘤细胞增殖和侵袭，诱导其凋亡。

一、DKK1甲基化与急性白血病

急性白血病(acuteleukemia，AL)是一种与表观遗传学相关的疾病，具有多基因、遗传学表型异质性特点。大量研究表明，AL的发生与DKK1基因表达异常有密切关系。DKK1基因甲基化，引起基因表达下调或沉默，其抑制Wnt信号通路作用失活，导致Wnt信号通路激活，进而引起肿瘤的发生。Griffiths等［9］研究表明，在169名原发性AML患者中，89%的患者骨髓冰冻样本或外周血组织样本有1个以上的抑制基因发生甲基化，其中DKK1甲基化率为16%，且其甲基化与AML患者的不良预后存在相关性;在检测的白血病细胞系(HL-60，K562，KG1，HNT34，KG1a，U937和HCT116)中至少50%的细胞都会发生DKK1甲基化。Valencia等［10］研究表明，在AML细胞系(kasumi-1，KGla，HL-60，THP-1)中DKK1基因都发生高甲基化，184例AML患者DKK1基因启动子区域高甲基化状态，甲基化发生率为32%。Suzuki等［11］研究发现，5例正常骨髓单核细胞样本DKK1不发生甲基化，而47例AML患者骨髓样本中DKK1甲基化率为29．8%，其中M2型病人更容易检测到DKK1的甲基化，甲基化发生率为42．3%，10个伴t(8;21)染色体易位的AML患者中有5人发生DKK1甲基化。Raji、Molt-3和SK-NO-1细胞系均可观察到DKK1甲基化，且多变量分析显示DKK1甲基化是不良预后的一个危险因素，与白血病的疾病进展有关，但病人的5年总生存率与是否发生DKK1甲基化没有明显的相关性;研究还发现，RUNX1/RUNX1T1，CBFB-MYH11或者PML-RARA融合基因常与DKK1甲基化伴随发生，均促进白血病形成，而存在FLT3/ITD突变的11个AML患者没有发现DKK1基因甲基化。这些结果显示，FLT3/ITD突变可能不与DKK1甲基化同时发生。Hou等［12］发现，在269例AML患者中，166人有1个以上的Wnt抑制基因发生甲基化，其中DKK1甲基化率为30．1%。这些研究表明所有的Wnt抑制基因的异常甲基化导致的甲基化上调可能是Wnt抑制基因失活的主要机制。国内朱珣珣等［13］研究发现，与正常对照组比较，AL患者DKK1基因mRNA表达显著降低，正常对照组单个核细胞标本不存在DKK1的甲基化，但AL患者中DKK1甲基化率为37．7%，其中急性淋巴细胞白血病(ALL)患者甲基化率为41．2%，AML患者中甲基化率为28．6%。一系列的研究发现，当DKK1基因启动子区域高甲基化，mRNA转录水平降低，DKK1蛋白表达降低，导致Wnt通路激活，从而引起AL的发生，且DKK1甲基化程度与病情的严重程度及预后有关。

二、DKK1甲基化与慢性白血病

慢性粒细胞白血病(CML)是具有Ph染色体和/或BCR-ABL融合基因阳性的造血干细胞恶性增殖性疾病。朱雅姝等［14］研究表明，脂肪间充质干细胞分泌的DKK1可以抑制慢性髓细胞白血病细胞K562的增殖。将DKK1基因用RNA干扰后与K562细胞共培养，可重新增加K562细胞Wnt信号通路中β-catenin表达，减弱对K562增殖的抑制作用。Zhu等［15］人研究发现，间充质干细胞分泌的DKK1蛋白是Wnt信号通路强有力的抑制剂，可以抑制K562细胞增殖;当DKK1基因被敲除或者使用抗体中和DKK1蛋白，DKK1对共培养的K562细胞的抑制作用则降低。Han等［16］研究表明，DKK1蛋白可以通过抑制Wnt信号通路，降低β-catenin含量，导致K562细胞凋亡增加，逆转最终急变期CML的骨髓间充质干细胞对K562细胞的保护作用，使β-cate-nin水平降低。Filipovich等［17］研究发现，尽管Wnt信号通路在CLL中激活，而健康的B淋巴细胞和CLL细胞表达的DKK1基因mRNA及LRP6水平是等量的，在CLL中DKK1可能不发挥作用。然而Moskalev等［18］人研究表明，在CLL中DKK1甲基化水平明显高于对照组，在EHEB和MEC-1细胞系中，DKK1甲基化发生率分别为68%和75%，12个CLL病人样本中DKK1甲基化发生率为34%。研究结果的差异可能由于选择的样本影响或者样本数量有限或者别的实验因素的影响，这需要进一步研究证明。这些研究表明，不同类型的慢性白血病中DKK1所起的作用可能不同，这为以后更深入的研究DKK1基因在慢性白血病中的功能提供参考。

三、白血病去甲基化治疗的新进展

去甲基化药物主要是指DNMT抑制剂。此类药物在小细胞肺癌、乳腺癌、白血病及骨髓增生异常综合征等疾病中的应用，获得了显著的疗效。去甲基化药物地西他滨(5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶，DAC)是一种天然的脱氧胞苷酸的腺苷类似物，特异性的DNA甲基化转移酶抑制剂，可逆转DNA的甲基化过程，激活沉默失活的抑癌基因，从而诱导肿瘤细胞向正常细胞分化或诱导肿瘤细胞凋亡。Moskalev等［18］研究表明，5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶在CLL细胞系中可以降低DKK1基因甲基化水平，然而并没有导致明显的DKK1基因的mRNA水平表达增加。Suzuki等［11］研究发现，当AML细胞株(SKNO-1)使用5-氮杂-胞嘧啶治疗4d后，观察到DKK1基因表达恢复，这提示DKK1甲基化抑制了DKK1基因表达。Va-lencia等［10］研究表明，地西他滨治疗AML后，DKK1基因的表达水平呈剂量依赖性增加。孟真等［19］研究发现，使用去甲基化药物三氧化二砷后在原本不表达抑癌基因SHP-1mRNA的HL-60细胞中，SHP-1得到表达，而高表达的原癌基因C-kit表达水平下降。当使用不同浓度的三氧化二砷作用后，SHP-1mRNA的表达水平呈剂量依赖性地上升，而C-kitmRNA的表达水平随剂量增加而下降。虽然地西他滨在白血病的治疗中取得了明显疗效，但由于使所有基因去甲基化，因此也有可能诱导肿瘤的发生。目前的研究主要是靶向诱导DKK1去甲基化，这在白血病中还没有新进展，但在多发性骨髓瘤已取得一定的成果。如针对DKK1蛋白抑制成骨细胞激活破骨细胞而导致的溶骨性病变，可使用DKK1的中和抗体、蛋白酶体抑制剂、多肽疫苗免疫治疗及调节因子等，这些方法均显示出较好的疗效［20］。另有研究表明，在结肠直肠癌中使用生物活性物质维生素D3可以通过增加DKK1基因表达来调控Wnt/β-catenin信号通路［21］。使用维生素D3(100nmol/L)治疗结肠直肠癌细胞株SW480-ADH，2d后肿瘤抑制基因DKK1表达增加，而致癌基因DKK4表达降低，其具体的机制还有待进一步研究证实，但这也为我们治疗提供了一个方向，或许在白血病治疗中也有一定的参考意义。

四、问题与展望

白血病作为一种血液系统恶性肿瘤一直威胁到人类的健康，应用去甲基化药物治疗血液系统恶性肿瘤已经成为目前的研究热点。由于基因甲基化的异常改变通常先于肿瘤的发生，而肿瘤细胞坏死和凋亡产生的DNA又会游离到血浆、血清、痰、尿液等体液中，因此可以检测这些体液中DKK1基因的甲基化情况，为肿瘤的早期诊断提供依据［22］。DKK1甲基化具有可逆性，因此去甲基化治疗可以使其恢复表达，起到抗肿瘤作用。但目前去甲基化药物治疗存在一定的问题，首先是其缺乏特异的靶向性。因此，在恢复抑癌基因表达的同时可能引起原癌基因以及全基因组的低甲基化从而诱发肿瘤。其次，这类药物具有可逆性，使用药物可以暂时使DKK1基因去甲基化，但仍有可能恢复到高甲基化状态，故需要长期持续应用才可以达到一定的效果，而大剂量应用去甲基化药物会对正常细胞产生细胞毒副作用。因此，寻找针对不同的抑癌基因的靶向的甲基化药物成为研究的重点以及难点。

作者：柳凤芝 王季石 朱红倩 单位：贵州省人民医院血液科 贵州医科大学附属医院血液科