青枯菌的组织病理学研习范文

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扫描电镜观察以青枯菌HX6为供试菌株，广藿香试管苗伤根处理后浸泡于浓度为0×108cfu/mL的菌液中，以无菌水浸泡的广藿香试管苗为对照。分别取青枯菌侵染后3、12、24、48、72h的植物样品，以体积分数5%戊二醛固定，4℃冰箱保存12h，再用磷酸盐缓冲液(PBS)(0.2mol/L、pH7.2)清洗3次，并于该PBS保存24h，用锋利的双面刀片迅速切取幼根及茎段2～3mm，沿纵切面剖开，经酒精梯度脱水，再用醋酸正戊酯置换，CO2临界点干燥后，喷金并镜检，采用扫描电镜观察并照相。

光学显微镜观察以青枯菌HX6为供试菌株，广藿香试管苗伤根处理后浸泡于浓度为0×108cfu/mL的菌液中，以无菌水浸泡的试管苗为对照。分别取青枯菌侵染1、2、4、7d及对照的植物样品，茎段粉末采用常规方法制备，并取叶片下表皮徒手制片，在光学显微镜下观察植株茎部导管及叶下表皮的变化情况。

统计方法实验数据均以均数±标准差(x珋±s)表示，采用SPSSStatistics17.0软件进行统计学分析，多处理的多重比较采用LSD方法测验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果与分析

1青枯菌对广藿香的致病效应在1周内，每天统计供试植株的病情指数(DI)，根据DI的计算公式，发病最重的DI值为100，完全无病为0。结果表明:伤根及不伤根的对照植株，在1周内均保持健康，DI值为0。青枯菌侵染的处理结果见图1。结果显示:在侵染前4d，伤根的植株发病更为严重，处理第4天时伤根植株的DI值为84.9，而不伤根植株的DI值为67.5。在侵染第5天时，不伤根处理的植株发病指数迅速增加，至第6天时，2种侵染处理的植株DI值均接近100。表明植株根部伤口有利于青枯菌快速入侵;植株没有伤根时，大量青枯菌聚集于植物根表组织，也能主动破坏根表细胞壁，再从根部入侵。

2青枯菌侵染广藿香的扫描电镜观察图2(见彩图页第287页)结果显示:对照幼根切面光滑，结构完整无损(图2-a);青枯菌侵染3、12h的根部样品中，未观察到青枯菌;侵染24h后，在根切面中可观察到少量的青枯菌，菌液中的细菌胞外分泌物也随之进入根部组织，可见白色絮状物质(图2-b);侵染48h后，青枯菌在根切面中大量聚集，根组织结构破坏(图2-c)。对照茎部导管完整，导管壁可见木质化增厚和纹孔(图2-d);青枯菌侵染3、12、24h的茎段切片中，未观察到菌体细胞，侵染48h后，茎部导管中可见青枯菌的定殖(图2-e);侵染72h后，青枯菌在茎部导管中逐渐增多，并可见大量白色絮状物，充填整个导管组织，导管壁破碎(图2-f)。

3青枯菌侵染后广藿香的组织病理变化图3(见彩图页第288页)结果显示:未经侵染的对照植株的茎部导管排列紧密，管壁可见环纹或螺纹木质化增厚(图3-a);青枯菌侵染2d后，导管间略微分离(图3-b);侵染4d后，导管弯曲残破，离析(图3-c);侵染7d后，导管出现扭曲及断裂(图3-d)。未经侵染的对照植株的叶下表皮细胞为不规则长方形或卵圆形，细胞排列紧密，结构完整，叶绿体饱满，呈扁平椭球形或者球形(图3-e);侵染2d后，表皮细胞部分瓦解，气孔微合，部分叶绿体解体(图3-f);侵染4d后，表皮细胞的细胞壁扭曲，气孔干瘪，叶绿体破坏，消失(图3-g);侵染7d后，表皮细胞壁残破，细胞内含物混为一体，气孔皱缩变形、关闭(图3-h)。

4青枯菌侵染后广藿香的表型变化青枯菌侵染广藿香的试验中观察到:植株表现为渐进的发病过程，侵染第1天时，绝大多数植株茎杆保持直立，叶片舒展;第2天时，叶子从上而下出现不明显的卷缩下垂，茎杆有所弯曲;第4天时，大部分叶片萎蔫失水，根部开始褐变;第7天时，叶片萎蔫枯黄，植株倒伏，绝大部分植株死亡。比较青枯菌侵染后植株表型及组织病理变化情况，结果表明植株的病程发展与其组织结构损伤破坏的进程较为一致。

讨论

研究青枯菌侵染广藿香的组织病理学与致病机制，可为从根本上揭示青枯菌致病的本质及寻找控制病害的途径提供理论依据。青枯菌侵染寄主植物，从接触、吸附、侵入、定殖到最后的扩展并引起枯萎死亡是一个复杂的过程。病原细菌的致病力由侵染力和致毒性决定。本研究结果表明:青枯菌对广藿香具有很强的侵染力，接种24h后，青枯菌在根部切片出现;48h时后，在茎部导管出现。

但病原细菌并非只要入侵植物导管分子就能导致枯萎的发生，病菌的致萎过程是伴随着细菌在输水组织内的大量增殖、移动及扩散，堵塞和或损坏导管及相邻组织而发生。本研究对青枯菌入侵广藿香的观察表明:青枯菌从根部入侵、在茎部导管定殖及扩张，同时，菌液中胞外分泌物也大量进入维管组织，充填并破坏植物的输导组织。随着侵染时间的延长，茎部导管离析、扭曲及破裂，随之，叶表皮组织由于得不到水分和养分的供给，逐渐解离，植株萎蔫死亡。

有关青枯菌的侵染途径，在其他植物中的研究表明:细菌主要从植物根部的伤口或天然孔口侵入，如伸根时的生理性伤口、细胞生长中自然造成的裂口、地下害虫及土壤线虫造成的伤口等，均有利于病菌侵入。本研究结果表明:青枯菌侵染后，伤根的广藿香植株发病更迅速，但不伤根的植株也表现出发病症状，且随着侵染时间的延长，不伤根处理病情指数迅速增加;侵染后期，2种处理的病情指数均达100，表明青枯菌在根表聚集后，除了从根表伤口侵入外，还可通过分泌一些胞外酶等物质破坏寄主细胞壁，再从破坏的根表细胞进入植株体内。广藿香连作年限越长，则土壤中积累的青枯菌越多，在高温多雨的季节，有利于青枯菌的繁殖和入侵，造成连作的土地发病更为严重。因此，在广藿香生产中应尽量避免连作，收获后应及时清除病残体，并进行土壤消毒。

作者：徐燃贺红邓素坚李润美杨玉秀邓志成金华单位：广州中医药大学中药学院