胆管转换的病理护理探究思考范文

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本文作者：李崇辉叶晟张爱群徐鸿滨潘可董家鸿黄志强单位：解放军总医院全军肝胆外科研究所北京

不同原因引起的肝内外胆管梗阻可引起胆源性肝纤维化。过去20年对于肝纤维化的研究主要集中于肝星状细胞(HSC)，活化的HSC可分泌纤维基质成分。近年来有研究提示，肝内胆管上皮细胞可通过上皮-间质表型转变(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)促进胆源性肝纤维化[1]。国外对原发性胆汁性肝硬变和原发性硬化性胆管炎病人的临床病理标本进行研究，发现这些病人肝组织中，胆管细胞可表达Vimentin、FSP1和Snail等，并且与TGF-β信号通路的活化相关，特别是在伴随胆小管增生时，但未发现肝细胞发生EMT[2-4]。本研究以经典的大鼠胆管结扎(bileductligation，BDL)后肝内胆汁淤积所致肝纤维化为模型，分析胆汁性肝纤维化时胆管上皮细胞发生EMT的特点。

材料和方法

1实验动物和试剂雄性Wistar大鼠，质量200g左右，由军事医学科学院实验动物中心提供。E-cadherin(H-108)兔多抗购自SantaCruz公司，抗Vimentin小鼠单抗购自Millpore公司，小鼠抗人CK19单抗(CloneMNF116)及α-SMA小鼠单抗购自Dako公司，兔抗人FSP1/S100A4多克隆抗体为Invitrogen公司分装。其他免疫组化学及免疫荧光所用试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2模型制作大鼠经2%戊巴比妥钠(50mg/kg，ip)麻醉，沿腹正中线切开，暴露胆总管，远近端结扎后中间剪断，关腹。假手术组仅开腹并游离胆总管后关腹。分别于术后1周和2周时将大鼠处死，取肝组织进行石蜡切片和冷冻切片。胆管结扎组每个时间点n=5，假手术组n=3。

3常规病理学观察石蜡切片经HE染色，光镜下观察肝小叶、门管区的胆管增生、纤维化及炎症细胞浸润情况。

4免疫组化检测将切片脱蜡，复水，3%H2O2处理10min，根据一抗说明书要求进行抗原修复。1%BSA-PBS封闭30min，加入稀释后的一抗，于湿盒中室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗涤3次。然后加入Polymer-horseradishperoxidase(HRP)标记的二抗，室温孵育1h。DAB显色，苏木素复染。光镜下观察棕黄色阳性信号的分布特点，以SONY三晶片高清晰CCD及Image-Pro软件进行图像采集。

5双标记免疫荧光检测冷冻组织切片经冷丙酮固定10min，PBS洗涤2次，1%BSA-PBS封闭30min。将切片同时与小鼠抗Vimentin单抗和兔抗E-cadherin多抗孵育，然后以不同荧光素标记的二抗检测上皮细胞标志蛋白和间质细胞标志蛋白，即用TRITC-标记的山羊抗兔二抗和FITC-标记的山羊抗小鼠二抗同时孵育，DAPI染核，抗荧光衰减封片剂封片。尼康荧光显微镜观察结果并照相。

结果

1HE染色胆管结扎组大鼠1周后耳、尾等部位皮肤黄染明显，体重无明显差异。假手术组大鼠肝脏显示正常肝小叶结构，胆管结扎组术后1周汇管区胆管细胞增生，呈花环状；2周时胆管增生范围扩大，汇管区间质细胞明显增多，发生纤维化(图1)。部分汇管区炎细胞浸润。胆管结扎组小叶内还可见局灶性肝细胞坏死区域。

2免疫组织化学染色CK19(Cytokeratin19)是胆管上皮细胞的标志性蛋白。假手术组大鼠肝组织小叶结构正常，每个汇管区含有2-5个棕染的胆小管。胆管结扎后1周，肝组织汇管区CK19阳性的小胆管样上皮细胞明显增多，常由3-5个阳性细胞组成花环样细胞团，有些细胞团内可见小管腔。2周后呈阳性染色的胆管细胞数量增加更多，并向小叶内浸润(图2)。

3间质细胞标志免疫组化染色Vimentin和FSP1/S100A4是间质成纤维细胞的标志，α-SMA是间质肌成纤维细胞标志。假手术组大鼠肝组织Vimentin表达阴性，胆管结扎1周时，肝组织汇管区内新生胆小管Vimentin呈强阳性，2周时除胆管细胞阳性外，汇管区其他细胞也表达Vimentin(图3)。假手术组大鼠肝组织内FSP1/S100A4阳性的细胞呈散在分布，可能为淋巴细胞和Kuffer细胞，胆管结扎1周和2周时的大鼠肝组织胆管细胞呈FSP1/S100A4中度阳性表达(图4)。但是两组大鼠胆管细胞均不表达肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA，α-SMA阳性的细胞除动脉壁外，主要分布于汇管区，紧密包绕于胆管细胞周围(图5)。

4免疫荧光双染胆管上皮细胞同时表达上皮细胞标志E-cadherin和间质细胞标志Vimentin(图6)。

讨论

从上皮细胞表型转变为间质细胞表型的过程被称作上皮-间质表型转变(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)[5]。而相反的转变称为间质-上皮转变(MET)。EMT在胚胎发育过程中具有十分重要的地位，现在越来越多的数据表明该过程在调控正常人体组织和肿瘤组织的细胞可塑性方面也起到了关键作用。成熟上皮细胞发生EMT时，表现为上皮标志物，如细胞角蛋白(cytokeratin)、上皮钙粘素(E-cadherin)和β-连环蛋白(β-catenin)等表达下调或丢失，出现间质细胞标志物，如波形蛋白(Vimentin)、纤维母细胞特异蛋白-1(fibroblastspecificprotein1，FSP1，又称为S100A4)和平滑肌动蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)等。

我们在胆管结扎诱导的胆源性肝纤维化大鼠模型中，发现门管区的胆管细胞不仅表达CK19，也表达间质细胞标志蛋白Vimentin和FSP1。波形蛋白是细胞骨架蛋白的一种，是间质来源细胞的标志蛋白，FSP1是早期成纤维细胞的关键标志蛋白，能够通过与细胞骨架和p53蛋白的C末端反应而改变细胞的运动和生长。在EMT发生的起始阶段，由于FSP1很快被诱导表达，可在原位鉴定到发生EMT的上皮细胞[6-7]。这些结果表明肝内胆汁淤积诱导胆汁性纤维化时，汇管区胆管在增生的同时，发生了向间质表型的转变。由于间质表型细胞在功能上十分活跃，细胞黏附力下降，迁移和运动能力增强，还可分泌多种细胞因子，通过自分泌或旁分泌的方式作用于邻近细胞，以加速纤维化进程[6]。但是BDL大鼠胆管上皮并不表达α-SMA，可能是由于在体内EMT标志并不像在体外那样所有的标志都能体现出来，例如I型胶原合成只在某些成纤维细胞亚群中表现出来，α-SMA只在肌成纤维细胞表达，而且FSP1+的细胞不表达α-SMA。

目前的研究还不能确定发生EMT的胆管细胞是通过直接转化为纤维基质生成细胞，还是通过活化其他类型细胞间接参与肝纤维化。最近有研究[8]利用YFP和CK19标记的小鼠胆管细胞进行示踪研究，发现肝纤维化时胆管细胞并未转变成α-SMA阳性肌成纤维细胞或FSP1阳性成纤维细胞，但是该研究未检测胆管细胞的Vimentin表达。研究还发现发生EMT的上皮细胞胶原合成增加，致纤维化因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)和促间质生长因子Hh(Hegehog)配体、PDGF-BB等分泌增加，因而可对门管区成纤维细胞起到促进作用。因此间质表型的胆管上皮细胞可能主要通过分泌细胞外基质和致纤维化因子促进其他间质细胞的增生。

胆管增生(胆小管反应)被认为在胆源性肝纤维化的启动和发展中发挥至关重要的作用[9]。BDL大鼠中增生胆管细胞发生EMT，那么EMT和胆管细胞增生之间关系如何？胆管细胞增生受到许多因素的调节，如胃肠激素、胆酸、生长因子(如EGF、HGF)、血管生成因子(如VEGF)、神经营养因子和细胞因子(如IL-6)等均可刺激胆管细胞增生，这些因子与胆管细胞发生间质表型转变的关系及分子机制有待于进一步深入研究。