猪非典型瘟病毒感染诊断研究范文
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摘要：2017年8月四川省某规模化猪场出现临产母猪产弱子、发抖、死胎，且死胎率达30％，哺乳仔猪成活率明显降低，其中以全身性或局部性阵发痉挛为典型症状。用RT－PCR扩增及序列分析确诊该猪场感染了一种新型的猪非典型瘟病毒（APPV）。这是四川省首次检测到并报道APPV，可为该病的研究和防控提供了一定的参考。
关键词：阵发痉挛；猪非典型瘟病毒；诊断
猪非典型瘟病毒（Atypicalporcinepestivirus，APPV）是近年来新发现的一种新型瘟病毒［1］，与猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）、牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）、边界病毒（Borderdiseasevirus，BDV）等同属瘟病毒属（Pestivirus）黄病毒科（Flaviviridae）［2］。猪群感染该病毒后可引起新生仔猪的先天性震颤症A－Ⅱ型（CT；myocloniacongenita），俗称“仔猪抖动病”，其特征是在出生后数小时内可观察到骨骼肌的双侧痉挛收缩，并造成无法吮乳的现象，严重时可损伤仔猪的脑和脊髓，给养猪业造成巨大的经济损失［3－4］。该病呈广泛的地理分布，病毒检出率也在日趋上升，自2015年在美国报道该病毒以来，又逐渐在德国、荷兰、西班牙、奥地利和中国等地相继被报道［1，5－9］。近年来，APPV已经引起越来越多的学者的关注［1，5－9］。2017年，该病在国内外的报道中被指出能够造成规模化猪场哺乳仔猪80％的发病率以及30％～60％的病死率［9－10］。经遗传进化分析表明APPV复杂多样，不同地区的分离株具有高度可变性［9］。本试验中对该猪场的患病猪及死亡猪进行临床诊断和实验室确诊，最终确诊为APPV感染。这也是首次证明了四川规模化猪场存在APPV感染。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1病料来源采集四川省某规模化发病猪场的新鲜死胎、弱仔。
1．1．2主要试剂与仪器Trizol试剂盒（RNAisoPlus），上海英骏生物科技有限公司产品；DEPC、酚、SDS试剂，Sigma公司产品；三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇等试剂，成都科龙化工公司产品；PKA酶，默克集团产品；QuickTaqHSDyeMix，东洋纺生物科技有限公司产品；MarkerⅡ、PrimeScriptTMRT试剂盒，大连宝生物公司产品；PCR产物纯化试剂盒，北京鸿跃创新有限公司产品；感受态细胞EscherichiacoliDH5α，北京天根生化科技有限公司产品；LB培养基，青岛海博试剂有限公司产品；高速离心机5804，Eppendorf公司产品；普通PCR仪、核酸蛋白电泳仪、凝胶成像系统VersaDoc2000，Bio－Rad公司产品。1．1．3引物参照文献［8，11］中瘟病毒（Panpesti－virus，PP）通用引物序列，猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiverespirato－rysyndrome，PRRSV）、猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV－2）和猪伪狂犬病病毒（Pseu－dorabiesvirus，PRV）的特异性检测引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。
1．2方法
1．2．1核酸的提取取心、脾、肺、肾、脑、淋巴结等组织器官并将其剪碎，同时取适量全血，所有样本都一式两份，分别根据RNA和DNA的提取方法进行操作。提取的DNA和RNA置于－80℃保存备用。利用PrimeScriptTMRT试剂盒将RNA反转录成cDNA并置于－20℃待用。
1．2．2PCR检测对提取的DNA和反转录后的cDNA模板，进行PCR扩增反应。取扩增产物经20g／L的琼脂糖凝胶核酸电泳和凝胶成像扫描仪进行检测。
1．2．3PCR产物的纯化、克隆以及转化对检测呈阳性的PCR产物按照PCR纯化试剂盒说明书进行操作纯化目的条带，并按照pMD19－T载体说明书进行加样，酶连体系如下：4．5μL回收产物，0．5μLpMD－19Tvector，5μLSolutionI，16℃，连接10h～12h。将上述的连接产物按照感受态细胞E．coliDH5α操作说明书进行转化，将菌液涂布在加了氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养。
1．2．4菌落PCR鉴定以及测序在37℃培养箱过夜培养的平板上随机挑取单菌落置于10μL的无菌水中，并取2μL作为模板做菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性的菌液加入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，摇菌10～12h后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1．2．5相似性及进化树分析将测序结果在NCBI上进行BLAST比对后，使用Megalign6．0软件进行相似性比对以及MEGA7的邻近法（Neighbor－joining）构建系统进化树，并通过自举分析（Boot－strap）作置信度检测，自举数据集为1000次。
2结果
2．1发病情况、临床症状和病理剖检
2017年3月以来，四川某规模化猪场，母猪陆续出现产死胎、木乃伊胎，死胎、木乃伊率达16％。随后发现部分母猪整窝出现初生仔猪全身不自主地抖动，头部摇摆，后肢无力，不能站立，行动迟缓，无法进行吸吮乳汁，但未见瘫痪症状，部分猪只逐渐出现死亡，个别猪只在2周～3周后可康复但同时也表现为预后不良。母猪发病率约为20％，不同窝内发病率为20％～100％，发病母猪各种胎龄均有发生。对消瘦的病死仔猪进行解剖，发现其脑血管周围、脑部、肺脏有出血，脾脏局部坏死灶和边缘梗死的情况（图1）；其他组织器官无明显病理变化。
2．2PCR检测
提取所采集的心、脾、肺、肾、脑、淋巴结等组织和全血的DNA和RNA，用PCR方法对CSFV、PRRSV、PCV－2和PRV等病原进行检测，结果均为阴性；再使用瘟病毒属通用引物对以上cDNA进行PCR扩增，并对PCR产物进行电泳检测，扩增片段约为800bp，与预期的818bp相一致（图2）。
2．3序列分析
将克隆转化后测序得到的序列在NCBI上进行BLAST序列比对，结果显示是APPV毒株（Atypicalporcinepestivirus）。用Magalign6．0分子生物学软件将测序得到的基因序列和GenBank上已经发表的参考序列进行序列同源性比对。结果显示该病毒的核苷酸序列与其他APPV参考株的核苷酸及氨基酸同源性分别为84．8％～92．1％和95．9％～98．1％，与其同源性最高的是德国株LT594521．1。
2．4系统进化树分析
为了进一步确定该病毒与国内外已发表的参考毒株之间的遗传进化关系，运用MEGA7生物学软件的邻近法构建其系统进化树状图，结果如图3所示。从核苷酸系统进化树中可以看出，瘟病毒目前可分为两大分支，APPV为一大分支，其他瘟病毒为另外一大支，该病毒与CSFV、BVDV、BDV同属瘟病毒属，但与APPV亲缘关系较近且单独聚为一支。本研究鉴定的APPV与德国毒株KU041639．1、澳大利亚毒株KX778724．1以及中国毒株（KY624591．1、KX950762．1、KX950761．1、KY612413．1）的序列亲缘关系较近，但单独聚为一支，说明本研究鉴定的APPV可能是一株新的毒株。
3讨论
在过去的十几年中，越来越多的新型瘟病毒已在国内外被发现［4－10］，在美国，德国，荷兰和奥地利等许多国家已被鉴定。2013年，在澳大利亚的数个猪场的新生仔猪群中暴发了重复性肌阵挛（“颤动仔猪”）［12－18］，大量仔猪可见营养失调，尤其是这种震颤综合征的并发症。由于此病暴发，仔猪总体死亡率增加，且每头母猪的断奶仔猪数降低了超过10％。2015年，通过宏基因组测序首次在美国的猪群中发现并确定一种与CT型A－Ⅱ相关的新型瘟病毒［2，16］。该病毒可以在患病仔猪的不同组织、体液和中枢神经系统中检测到，并且在APPV呈阳性的母猪和先天性震颤感染的仔猪的血清中检测到AP－PV特定抗体，同时对感染仔猪的中枢神经系统进行组织学检查发现小脑和脊髓的白质出现中度的髓鞘形成减少［9］。在本试验中，通过RT－PCR方法在哺乳仔猪中检测到APPV，这是四川省首次检测到并报道该病毒。本研究中患病猪的临床症状为APPV典型症状全身性或局部性阵发痉挛。首先利用PCR方法排除了CSFV、PRRSV、PCV－2和PRV等病毒的感染。运用瘟病毒通用引物对样本进行RT－PCR扩增，电泳结果显示扩增片段与预期目的条带818bp相近，经过序列分析比对，说明该毒株是一株AP－PV。通过克隆测序，本研究鉴定的病毒与其他AP－PV参考株的核苷酸及氨基酸同源性分别为84．8％～92．1％和95．9％～98．1％；从目前的研究来看，与中国广州毒株PPV1（KY652092）和GD2（KX950762）同源性相对较低，分别为91．4％和84．8％。系统进化树构建和同源性分析表明，中国发现的APPV毒株存在地域差异性。遗传进化结果表明本研究鉴定的APPV可能是一种新的毒株。本研究首次在四川地区规模化猪场确定APPV的感染，且有与国内APPV毒株具有明显的遗传差异，我们将进一步对该病毒的分子特征和致病机制进行探究。由于该病目前也没有预防用生物制品，建议该猪场应加强猪场管理，严格执行检疫制度，坚持自繁自养，减少健康猪同病猪之间直接或间接的接触。严禁从有疫病的国家和地区引进种猪、猪精液与胚胎和血液制品，从非疫区引进的种猪要严格检疫。引进种猪到猪场后应严格隔离观察8周以上。同时加强猪舍消毒，实行全进全出制度。使用优质疫苗对猪群进行免疫，提高防疫效果。
作者：周可磊 陈新诺 岳华 张斌 单位：西南民族大学生命科学与技术学院