人乳头瘤病毒感染与结直肠癌相关性研究范文

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摘要：目的检测195例结直肠癌样本中人乳头瘤病毒（HPV）的感染情况。方法利用通用PCR法检测结直肠癌样本中的HPVDNA，随后用荧光定量PCR和直接测序法对HPVDNA阳性样本进行HPV分型，同时统计HPV阳性标本的Kras、PIK3CA和BRAF基因突变情况和临床病理特征。结果结直肠癌标本中HPV感染阳性率为17.94%（35/195），以HPV16、18型感染为主，且存在混合感染；HPV感染阳性标本中Kras基因突变率为42.85%，PIK3CA、BRAF基因突变率均为2.86%，HPV感染与三个基因突变的相关性均无统计学意义；阳性标本中以右半结肠的癌变居多，癌组织以中分化为主，临床Ⅱ期多见，多无淋巴结的转移。结论HPV感染可能与结直肠癌的发生有关，但与Kras、PIK3CA、BRAF基因突变无关。

关键词：人乳头瘤病毒；结直肠癌；通用PCR；突变

结直肠癌已成为最常见的恶性肿瘤之一，近年来，国内外有研究表明结直肠癌的发生可能与人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）的感染有关，但一些研究结果的检出率低或未检测到HPV病毒，这可能与人群种族、标本来源、标本数量及检测方法有关。另有资料显示Kras、PIK3CA和BRAF基因突变与结直肠癌的发生密切相关。因此本研究利用针对HPVL1区通用引物的PCR法检测结直肠癌样本中HPV⁃DNA的存在情况，并用荧光定量PCR和直接测序法对HPV阳性样本进行分型，同时调查Kras、PIK3CA和BRAF基因突变与结直肠癌HPV感染的相关性。

1材料与方法

1.1样本来源

收集2014年7月至2016年6月共195例结直肠癌标本，均来自广州医科大学附属肿瘤医院住院手术病人。其中男性114名，女性81名，中位年龄62岁。

1.2主要试剂和仪器

人乳头瘤病毒检测试剂盒和人乳头瘤病毒核酸分型荧光PCR检测试剂盒购自潮州凯普生物化学有限公司；DNA提取试剂盒、Kras基因突变检测试剂盒、PIK3CA基因突变检测试剂盒和BRAF基因突变检测试剂盒购自厦门艾德生物医药科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；超微紫外可见分光光度计购自美国Thermofisherscientific公司；PCR扩增仪购自美国ABAppliedBiosystems公司；ABI7500荧光定量PCR仪购自美国Life公司。

1.3方法

1.3.1肿瘤组织DNA提取

组织切片经病理评估合格后，严格按照厦门艾德生物医药科技有限公司的DNA提取试剂盒说明书进行肿瘤组织DNA提取。所提DNA经微量紫外分光光度计检测提取质量和浓度，DNA的A260/A280在1.8~2.0之间，DNA-20℃保存。

1.3.2通用PCR法筛查

PCR反应体系共25μl，包括23.25μlPCR混合液、0.75μlDNATaq酶、1μlDNA模板。阳性对照为HPV18克隆质粒，内参为globin基因，阴性对照为ddH2O。反应条件为95℃预热9min，95℃20s，55℃30s，72℃30s，40个循环，最后72℃延伸5min。

1.3.3荧光定量PCR法HPV分型

荧光定量PCR反应体系共25μl，包括17.50μlPCR混合液、0.50μlDNA聚合酶、2μlDNA样本。反应条件为：95℃预热10min，95℃15s，60℃60s，45个循环，最后38℃延伸5s。荧光信号采集点设在60℃60s，仪器运行中进行实时荧光定量检测，仪器运行结束后直接在荧光定量PCR检测仪上读取荧光值。当空白对照Ct值下显示为Undet，阳性对照Ct值≤36，实验才视为有效。

1.3.4琼脂糖凝胶电泳

配制2%琼脂糖凝胶，取PCR扩增产物5μl与1μlLoddingBuffer混合后，加入凝胶板上的加样孔。电压120V/cm，电泳30min。电泳完毕取出凝胶，采用凝胶成像分析系统分析结果。

1.3.5PCR产物序列测定

将初筛阳性结果切胶回收，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒提纯出目的DN段，用超微紫外可见分光光度计测量回收的DNA浓度。纯化的PCR产物送至潮州凯普生物化学有限公司进行测序。1.3.6Kras、PIK3CA和BRAF基因突变按Kras基因突变检测试剂盒、PIK3CA基因突变检测试剂盒和BRAF基因突变检测试剂盒操作说明进行加样，三个项目都可用同一个程序，PCR反应参数如下：95℃5min，1个循环：95℃25s，64℃20s，72℃20s，15个循环；93℃25s，60℃35s，72℃20s，31个循环。在第三阶段60℃收集信号。

1.4统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计分析，分析HPV阳性标本与Kras、PIK3CA和BRAF基因突变关系用配对四格表的χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1通用PCR法筛查HPV⁃DNA检测结果

通用PCR法筛查195例结直肠癌标本，初筛阳性的标本35例，初筛阳性率为17.94%（35/195）。结直肠癌PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，结果显示在450bp出现目的条带。

2.2荧光定量

PCR和直接测序法检测HPV⁃DNA对HPV初筛阳性的标本进行荧光定量PCR和直接测序，证实均存在HPV感染，以HPV16、18型感染为主，且存在HPV混合感染。2.3HPV感染与Kras、PIK3CA和BRAF基因突变的相关性HPV感染阳性标本中Kras基因突变率为42.86%（15/35），PIK3CA基因突变率为2.86%（1/35），BRAF基因突变率为2.86%（1/35）。在结直肠癌病例中，HPV感染率分别与Kras、PIK3CA和BRAF基因的突变率比较，差异均无统计学意义、（P>0.05），说明HPV感染与三个肿瘤驱动基因的突变可能无关，见表2。2.4HPV感染与结直肠癌病理特征的关系HPV感染阳性标本中以右半结肠的癌变居多（23/35），其次为直肠（10/35）；癌组织以中分化为主（32/35）；临床分期以Ⅱ期多见（19/35），其次为Ⅳ期（8/35）；病例中多无淋巴结的转移（25/35）。

3讨论

HPV病毒是一种嗜上皮细胞病毒，主要感染皮肤黏膜的上皮细胞，与上皮来源肿瘤的发生、发展有关。HPV病毒DNA由上游调节区（URR）、早期转录区（E区）和晚期转录区（L区）组成。其中E区包括6个开放阅读框，依次为E1、E2、E4、E5、E6、E7，与肿瘤的发生有关。L区包括L1、L2，其中HPV⁃DNA的L1区为最为保守的区域。在宫颈癌中，HPV检出率达到90%以上。近年国内外有研究报道HPV感染与结直肠癌的发生有关，但相关的研究结果差异较大。Li等采用基因芯片方法检测结直肠腺癌，HPV感染率为48.4%；Bernabe⁃Dones等采用巢式PCR方法在西班牙浸润性结直肠癌检出率为42.2%；Burnett⁃Hartman等采用实时荧光定量PCR的方法在西雅图555例结直肠癌标本中检出率只有2%；Gazzaz等用杂交捕获的方法检测，结果显示阳性率为0.8%。其原因可能与人群种族、标本来源、标本数量及检测方法相关，同时病理标本经石蜡的包埋后会造成DNA的降解，造成阳性率降低也是不容忽视的。在Lorenzon等报道中，虽然HPV⁃16在结直肠感染率达到57.1%，但其用含有完整游离HPV16基因的细胞株作比对，对阳性标本中HPV⁃16基因进行相对定量，却发现非常低的量在组织中，其认为不排除从肛门或临床处理过程中污染的结果。

认为病毒将其E6、E7基因整合到癌细胞的DNA中，其余基因大多数丢失或者呈游离状态，以E6、E7以外的基因为目的区域进行检测将导致低阳性率或出现阴性结果。HPV病毒的检测方法有原位杂交、基因芯片法以及以PCR为基础的检测方法等。其中原位杂交法敏感性较低，方法费时；基因芯片法灵敏度高，但费用较高；PCR法灵敏度及特异性都较高，且其中的实时荧光定量PCR能进行定量和分型的优点。本研究针对L1区保守区域设计通用引物，通过PCR方法筛选出阳性标本再进行荧光定量PCR和直接测序分型。同时调查Kras、PIK3CA和BRAF基因突变情况与结直肠癌HPV感染是否有关。实验结果显示阳性率为17.94%，HPV感染的主要型别为HPV16、18型，且存在混合感染，提示结直肠癌与HPV感染有一定的关系，这与Laskar等结果是相一致。阳性标本中Kras基因突变率为42.85%，PIK3CA、BRAF基因突变率均为2.85%，HPV感染与三个基因突变的相关性均无统计学意义。综上所述，本研究显示HPV感染可能与结直肠癌的发生有关，但目前没有研究明确表明HPV参与了结直肠癌的发展，HPV感染如何导致结直肠癌的发生还有待进一步的研究。

参考文献：

［1］罗妙玲，徐韫健.结直肠癌KRAS、BRAF及PIK3CA基因突变状态分析［J］.热带医学杂志，2016，16（7）：843-846.

作者：李志阳1；陈舒颖1；张先言2 单位：1.广州医科大学附属肿瘤医院检验科，2.广东医科大学医学检验学院