慢性乙型肝炎病毒感染者探究范文

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［摘要］

目的测定未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者CD8+T细胞中Toll样受体2(TLR2)的水平，探索TLR2在慢性HBV感染者CD8+T细胞中的表达的情况。方法采用实时荧光定量PCR检测40例样本的血清HBV载量，分为高病毒载量组(HBVDNA＞1×104拷贝/mL)、低病毒载量组(HBVDNA＜1×104拷贝/mL)，19例志愿者作为健康对照组;分离外周血单个核细胞，流式细胞术检测CD8+T淋巴细胞亚群中TLR2和CD38、HLA-DR、CD95、程序性死亡蛋白1(PD-1)的表达，并分析TLR2表达情况及与它们之间的相关性。结果低病毒载量组与高病毒载量组CD8+T细胞TLR2的表达较健康对照组高，低病毒载量组CD8+T细胞TLR2表达高于高病毒载量组;相关性分析结果显示CD8+T细胞亚群中TLR2和CD38、HLA-DR、CD95、PD-1表达缺乏相关性。结论HBV感染者CD8+T淋巴细胞TLR2的表达增强。

［关键词］

Toll样受体2(TLR2);乙型肝炎病毒(HBV);CD8+T细胞;免疫活化;耗竭

人感染乙型肝炎病毒后，CD8+T细胞介导的免疫应答对肝脏炎症的发生、发展起着重要的作用［1－2］。一方面CD8+T细胞的持续活化是引起自身免疫、最后导致肝细胞受损的主要原因;另一方面，在慢性炎症发展过程中，CD8+T细胞凋亡增多、不能彻底清除病毒是HBV持续存在的重要机制［3－4］。因此，调控CD8+T细胞的活化与凋亡，对了解HBV感染者病情的发展及转归具有十分重要的意义。Toll样受体2(Toll-likereceptor2，TLR2)为TLR家族成员，其主要通过识别脂蛋白、脂多肽等病原相关分子模式引发细胞内信号通路导致炎症发生，在天然免疫防御中起重要作用，并最终激活获得性免疫系统［5］。本课题组前期研究发现，在HBV感染过程中，HBV复制活跃的感染者外周血单个核细胞中TLR2的蛋白水平和mRNA水平表达明显低于HBV复制不活跃的感染者和健康对照者［6］。但由于PBMC的组成比较复杂，包括单核细胞、自然杀伤(naturalkiller，NK)细胞、树突状细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞等。因此，本研究首先检测TLR2在慢性HBV感染者CD8+T细胞表面的表达情况。其次，TLR2作为共刺激受体可以表达在活化的T细胞表面［7］，说明TLR2与T细胞的活化和功能密切相关，因此我们同时还检测了CD8+T细胞表面与活化相关的CD38、HLA-DR分子和与凋亡相关的死亡受体Fas(CD95)、程序性死亡蛋白1的表达水平。并通过比较TLR2与这些分子表达的相关性，进一步确定慢性HBV感染者CD8+T细胞表面TLR2的表达是否与CD8+T细胞的活化或凋亡相关。

1材料和方法

1．1材料

1．1．1研究对象依据2010年慢性乙型肝炎防治指南(2011年更新)［8］的乙型肝炎患者诊断标准，采集慢性乙型肝炎患者的外周静脉抗凝血。所有血液样本均来自广西中医药大学第一附属医院临床门诊，包括HBV感染者40例，其中男25例，女15例，年龄12～68岁，平均年龄45岁，研究经医院伦理学委员会批准，患者知情同意。所有感染者按照HBVDNA载量分为2组［9］:高病毒载量组，HBVDNA大于1×104拷贝/mL，共20例;其中男12例，女8例，年龄20～68岁，平均(45±15)岁，所有病例经临床检测血清乙型肝炎病毒表面抗原阳性、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitisBviruseantigen，HBeAg)阳性、乙型肝炎病毒e抗体阴性，ALT持续或反复升高。低病毒载量组，HBVDNA阳性但病毒载量小于1×104拷贝/mL，共20例，其中男13例，女7例;年龄12～62岁，平均年龄43岁，所有病例经临床检测血清HBsAg阳性，HBeAg持续阴性，HBeAb阳性或阴性，ALT持续或反复异常，或肝组织学检查有肝炎病变。本研究另设健康对照组，均来自健康体检者，共19例，其中男8例，女11例;年龄21～62岁，平均年龄34岁，身体健康，无免疫病史及免疫治疗史。三组间年龄、性别差异无统计学意义，具有可比性。

1．1．2本研究所用主要试剂和仪器人淋巴细胞分离液购自Solarbio公司、RPMI1640培养基购自Hyclone公司、别藻蓝蛋白标记的抗人CD3抗体(CD3-APC)、藻红蛋白标记的抗人CD8抗体(CD8-PE)、AlexaFlour488标记的抗人TLR2抗体(TLR2-AF488)购自BD公司、藻红蛋白-花青素7标记的抗人CD95抗体(CD95-PE-Cy7)、APC标记的抗人PD-1抗体(PD-1-APC)、多甲藻黄素-叶绿素-花青素5．5标记的抗人CD38抗体(CD38-PerCP-Cy5．5)、AlexaFlour700标记的抗人HLA-DR抗体(HLA-DR-AF700)均购自Biolegend公司，其余化学试剂均为进口或国产分析纯。LSRFortessa型流式细胞仪购自BD公司，1-14型离心机购自Sigma公司，ST16R型低温超速离心机购自ThermoFisherScientific公司，ResearchPlus系列可调微量移液器购自Eppendorf公司，光学显微镜购自徕卡公司。

1．2方法

1．2．1PBMC悬液的制备采集受试对象外周肝素抗凝血液2mL，充分混匀，加入PBS，以1∶1比例将血液稀释混匀，使用人淋巴细胞分离液，密度梯度离心法分离获得PBMC，进行细胞计数，调整细胞数至1×104个/mL。

1．2．2流式细胞术检测CD8+T淋巴细胞亚群中TLR2和CD38、HLA-DR、CD95、PD-1的表达取1．5mL离心管，加入100μLPBMC悬液;严格按照说明书将相应的荧光基团标记抗体:CD3-APC、CD8-PE、TLR2-AF488、HLA-DR-AF700、CD38-PerCP-Cy5．5、CD95-PE-Cy7、PD-1-APC，加入离心管底并充分混匀，4℃避光孵育30min;加入PBS液800μL洗细胞，共2次;加入1mL40g/L多聚甲醛溶液重悬细胞，2h后用流式细胞仪进行检测。

1．2．3统计学分析采用Prism6．0统计软件进行分析，所有数据结果以x±s表示。采用成组设计2样本均数t检验统计方法比较不同病毒载量组与健康对照样本CD8+T细胞TLR2表达差别，P＜0．05表示差异有统计学意义。同时分析CD38、HLA-DR、CD95、PD-1各指标间的相关性。

2结果

2．1HBV感染者CD8+T细胞群中TLR2表达增强，以低病毒载量组更明显健康对照组、低病毒载量HBV感染者、高病毒载量HBV感染者CD8+T细胞群中TLR2表达量分别为0．653±0．332、4．635±2．874、2．185±1．074。与健康对照组相比，低病毒载量HBV感染者和高病毒载量HBV感染者的TLR2表达量升高，差异均具有统计学意义(P＜0．01);与高病毒载量组比较，低病毒载量组HBV感染者的TLR2表达升高，差异具有统计学意义(P＜0．01，图1)。

2．2HBV感染者CD8+T细胞群TLR2与细胞活化与凋亡不相关HBV感染者CD8+T细胞TLR2表达与CD38、HLA-DR、CD95、PD-1的表达均无相关性(r=0．005、r=0．064、r=－0．172、r=－0．007，P＞0．05，图2)。

3讨论

CD8+T细胞是抗HBV免疫应答主要的效应细胞，病毒短暂感染、持续性感染、肝细胞损伤轻微或严重程度均与CD8+T淋巴细胞在体内的活化与耗竭情况相关［10－12］。CD8+T细胞主要通过接受抗原提呈细胞(antigenpresentingcell，APC)提呈抗原，在共刺激分子的作用下分化为效应性细胞或凋亡细胞，这个过程有很多分子参与，包括CD8+T细胞表面的活化分子CD38、HLA-DR和凋亡分子CD95(Fas)、PD-1等。TLR2是TLR家族中表达范围最广，识别病原微生物种类最多的成员［13］。表达在固有免疫细胞表面的TLR2主要通过识别病原体表面的配体，促进APC对病原体的吞噬，同时也通过诱导巨噬细胞、树突状细胞(dendriticcells，DC)活化，分泌多种细胞因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、IL-6、IL-8等发挥免疫作用，属固有免疫范畴［14－15］。表达在适应性免疫细胞表面的TLR2，因识别的配体不同可正向或负向的调节T细胞的活性、功能和促进细胞因子产生等作用，并可作为共刺激受体延续和激活记忆性T细胞［16－19］。

本研究结果表明，无论高病毒载量还是低病毒载量的慢性HBV感染者CD8+T细胞表面TLR2表达与健康对照组比较均升高，并且低病毒载量组CD8+T细胞TLR2的表达明显高于高病毒载量组TLR2的表达，提示TLR2可能参与CD8+T细胞抗HBV病毒及HBV感染慢性化的过程。为进一步验证HBV感染者CD8+T细胞表面TLR2表达与CD8+T细胞活化与耗竭的相关性，本研究同时检测了相应HBV感染者CD8+T细胞表面与活化和凋亡相关的免疫分子的表达水平。CD38分子和HLA-DR均是T细胞免疫活化的标志，在许多急性或慢性感染中，T细胞表面CD38和HLA-DR的表达均会升高［20－21］。而CD95主要介导T淋巴细胞的凋亡，PD-1是一种重要的免疫抑制分子，在外周血免疫耐受中发挥着重要的作用。慢性HBV感染过程中，这2个分子在T细胞表面表达均升高［22－25］。

本研究结果表明，这4个分子在慢性HBV感染者CD8+T细胞表面的表达亦升高(结果未显示)，但与TLR2的表达是否有相关性呢?我们进行了相关性分析，结果表明，HBV感染过程中，CD8+T细胞TLR2的表达与CD38、HLA-DR、CD95、PD-1的表达不存在相关性，提示TLR2在HBV感染者CD8+T细胞上的表达与T细胞的活化及耗竭无关。但值得关注的是，HBV感染过程中，无论是高病毒载量组或低病毒载量组，CD8+T细胞TLR2均维持高水平表达，因此是否还存在着其他机制来说明CD8+T细胞TLR2表达的意义，还需进一步的实验研究来证实。

作者：运晨霞 肖健 康迪 王启辉 彭丽姗 刘显 冷静 单位：广西特色实验动物病证模型重点实验室 广西中医药大学医学免疫学与微生物学教研室 郑州市儿童医院检验科 广西医科大学免疫学教研室