子宫内膜癌细胞表达纤维蛋白原的检查范文

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[摘要]目的探讨子宫内膜癌细胞是否表达纤维蛋白原。方法纳入于医院接受子宫切除手术的16例子宫内膜癌患者（内膜癌组），同期4例良性子宫肿瘤切除的病例（对照组），采用Westernblot和qRT-PCR实验，分别检测各子宫内膜组织标本中纤维蛋白原蛋白和三链（a、b、g）mRNA表达水平。结果Westernblot检测结果显示，81.25%（13/16）的内膜癌组标本存在纤维蛋白原蛋白表达，而对照组未观察到其表达；qRT-PCR检测结果显示，内膜癌组有7例标本（43.8%）存在至少一个纤维蛋白原链mRNA的表达，而对照组均未观察到其表达。表达纤维蛋白原mRNA的全部7例标本在Westernblot检测中均呈较高水平表达。结论绝大多数子宫内膜癌细胞具备表达纤维蛋白原的能力，是子宫内膜癌高纤维蛋白原血症的重要来源之一。

[关键词]子宫内膜癌；纤维蛋白原；表达

子宫内膜癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一[1]。近年来子宫内膜癌导致死亡风险急剧上升[2]。因此，深入探讨子宫内膜癌的生物学行为，对改善其诊断和治疗策略具有重要价值。纤维蛋白原是一类340kD的二聚体蛋白，由三种多肽链构成（a、b和g链）。通常认为，纤维蛋白原由肝脏产生分泌，进入血液循环，其浓度为200~380mg/L，半衰期为4d[3]。最近，子宫内膜癌的相关研究显示，术前高纤维蛋白原水平与肿瘤临床分期较晚相关，是患者预后差、生存期短的标志物[4]。然而，肿瘤组织是否产生纤维蛋白原，尚存在很多争议。本研究拟通过Westernblot和qRT-PCR技术检测子宫内膜癌的纤维蛋白原表达情况，探讨子宫内膜癌细胞是否表达纤维蛋白原。

1材料与方法

1.1标本来源

收集2014年1月~2015年4月在医院行子宫切除术的16例子宫内膜癌和4例子宫良性肿瘤患者的子宫内膜组织标本，排除子宫内膜增生患者及慢性炎症性疾病、凝血障碍疾病或其他原因造成的异常纤维蛋白原血症患者。

1.2Westernblot检测

用蛋白裂解液[20mmol/LTris（pH8.0），137mmol/LNaCl，20mmol/L二硫苏糖醇（DTT），1%NP-40.2mmol/L钒酸钠，100μg/ml苯甲基磺酰氟，1μg/ml抑蛋白酶肽]充分裂解组织标本，冰浴30min，12000转/min离心10min。取上清，BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物公司）定量蛋白。取等量蛋白上样，采用12%的SDS-PAGE凝胶电泳，半干式转移法转至硝酸纤维素膜。用5%的脱脂牛奶封闭后，使用相应的抗体杂交后，采用BeyoECLPlus超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天生物公司)，在凝胶成像化学发光检测仪ChemiDocTMXRS+(美国Bio-rad公司)显色检测，GAPDH作为检测内参。

1.3qRT-PCR检测

按照总RNA提取试剂盒（大连宝生物公司）说明书，分别提取组织标本的总RNA，所得RNA纯度经鉴定符合实验要求。使用RT-PCR试剂盒（大连宝生物公司）进行反转录和PCR扩增，GAPDH作为RT-PCR实验的内参。参考文献[5]的方法，并经BLAST验证引物特异性，确定并合成纤维蛋白原a、b、g链的PCR扩增引物（英骏生物技术有限公司，中国上海），序列如表1所示。使用CFX96TMrea-timesystem荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）检测。q-RTPCR切点阈值设置为对照组人群纤维蛋白原相应链均值加上3倍标准差，高于该值即为阳性表达。

1.4统计学方法

应用SPSS19.0统计软件分析数据，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以例和百分率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Westernblot检测结果

16例子宫内膜癌标本中，3例呈现低表达，其余13例（81.3%）呈现中高度表达（图1），而对照组4例标本均未观察到阳性表达，两组阳性表达率有显著差异（P＜0.01）。

2.3qRT-PCR检测结果

子宫内膜癌组中，7例（43.8%）存在至少一个纤维蛋白原链mRNA的表达，其中2例（12.5%）表达a链mRNA，5例（31.3%）b链，4例g链（25.0%），4例同时表达b和g链。而对照组未观察到纤维蛋白原链mRNA的表达。表达纤维蛋白原mRNA的全部7例标本在Westernblot检测中均呈较高水平表达。

3讨论

高纤维蛋白原血症参与调控肿瘤恶性生物学行为，可能与肿瘤引发全身炎症反应相关，因此，高纤维蛋白原血症是恶性肿瘤的潜在标志[6]。但是，高纤维蛋白血症的成因却存在争议。本研究通过对子宫内膜癌组织进行Westernblot和qRT-PCR检测，证明子宫内膜癌细胞具有产生纤维蛋白原的能力。体外实验证明，恶性肿瘤细胞能够产生纤维蛋白原[7]；临床宫颈细胞、肺癌和肠癌组织的细胞浆内可以检测到纤维蛋白原的mRNA[8-9]。动物实验检测结果也显示，纤维蛋白原缺失的转基因小鼠的肿瘤细胞侵袭迁移能力较弱。研究发现，纤维蛋白和血小板的聚合物，可以庇护肿瘤细胞逃逸免疫细胞的监视[10]。此外，纤维蛋白原可以结合参与新血管生成和细胞增殖的相关因子（如成纤维细胞生长因子2、血管内皮生长因子），从而参与促进肿瘤的生长[11]。此外，纤维蛋白原与肿瘤细胞外基质表达的受体整合素相互作用，从而使转移性肿瘤细胞定植到远处组织[11]。上述研究结果都证明纤维蛋白原在肿瘤转移中发挥重要作用。因此，肿瘤细胞通过表达纤维蛋白原可能导致恶性生物学行为，具有更高的侵袭转移能力。

子宫内膜癌患者的高纤维蛋白原血症与不良预后之间存在显著联系[4]，但尚未明确的是纤维蛋白原水平上升导致的血浆高凝状态，是由于肝脏释放纤维蛋白原增加，还是肿瘤本身产生的所致。本研究发现，43.8%的子宫内膜癌患者存在至少纤维蛋白原一个链的mRNA表达，而对照组均无表达。Westernblot分析显示，纤维蛋白原高表达仅见于子宫内膜癌患者，而对照组没有。纤维蛋白原是否可作为鉴别子宫内膜癌良恶性的指标，有待进一步的大样本、多中心、多病变组织的深入研究证实。既往免疫组化和PCR分析支持肿瘤细胞具有合成纤维蛋白原的能力。一项体内研究证实，比较术中肺癌病变肺叶的肺静脉和上腔静脉的血浆，发现肿瘤组织是纤维蛋白原的来源之一[12]。本研究进一步证明，在子宫内膜癌组织，癌细胞具有纤维蛋白原分泌功能，是子宫内膜癌患者血清纤维蛋白原的重要来源之一。但本研究尚未发现纤维蛋白原三链mRNA阳性表达的病例，可能是由于患者数量偏少，或者是情况确实如此，有待扩大样本量进一步的验证。总之，本研究证实了子宫内膜癌细胞具备合成并分泌纤维蛋白原的能力，是患者高纤维蛋白原血症的重要来源。子宫内膜癌细胞分泌纤维蛋白原的相关机制及其治疗价值，是未来研究的重要内容。

作者：雷放；谢先丰