葡萄糖对卵巢癌细胞生长增殖影响范文

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【摘要】目的葡萄糖是维持肿瘤细胞存活的重要能量来源，有关研究表明低糖与无糖条件有可能抑制肿瘤细胞生长，成为潜在的肿瘤治疗方式。本研究通过给予不同浓度葡萄糖刺激SKOV3与A2780卵巢癌细胞系，分析其细胞增殖、细胞周期与细胞凋亡的改变，探讨葡萄糖对卵巢癌细胞生长增殖的影响。方法在体外配制含不同葡萄糖浓度（0、2．5、5．5、25．0mmol／L）的培养基，分别模拟无糖、低血糖、正常血糖及高血糖水平的体内环境，观察不同葡萄糖浓度对卵巢癌细胞的增殖、凋亡与细胞周期的影响。结果高糖促进卵巢癌细胞SKOV3和A2780的增殖，干预48h后，增殖幅度约为无糖组的1．841～1．942倍；低糖与无糖条件诱导卵巢癌细胞发生G1期阻滞，与高糖组相比，SKOV3细胞G1期比例以（40．699±1．131）％增加至（58．619±2．643）％，A2780细胞以（46．348±2．150）％增加至（54．770±2．475）％；低糖与无糖条件亦诱导细胞凋亡，SKOV3与A2780细胞无糖组中凋亡细胞比例分别为（14．015±0．827）％和（12．930±1．127）％。结论本研究通过探讨葡萄糖对卵巢癌细胞生长与增殖的影响，证明低糖与无糖条件诱导卵巢癌细胞发生G1期阻滞、细胞凋亡并抑制其生长增殖。若进一步给予相应葡萄糖抑制剂干预，可能为卵巢癌的临床治疗提供新思路。

【关键词】卵巢癌；葡萄糖；细胞增殖；细胞周期；细胞凋亡

目前，卵巢癌是妇科恶性肿瘤中引发患者死亡的主要原因［1］，约75％的卵巢癌患者在确诊时已处于疾病晚期阶段，该类患者在确诊时多已伴有肿瘤局部侵犯或远处转移等症状，常侵及子宫、肝脏、胸膜等器官，伴淋巴结转移。卵巢癌的基本治疗方案通常包括分期手术或肿瘤减灭术，以及联合铂类药物与紫杉醇的新辅助化疗［2－3］。尽管该一线治疗方案在短期内治疗效果尚可、可获得较高反应率，但大多数卵巢癌Ⅲ期或Ⅳ期患者经治疗后对化疗药物易产生抗药性，其5年生存率＜40％［4－5］。因此，急需新的治疗手段来改善卵巢癌患者的生存及预后情况。流行病学数据显示，2型糖尿病患者患卵巢癌的风险增加［6］。此外，患有糖尿病的卵巢癌患者已被证实具有较低的存活率。另有研究证实，代表卵巢癌发生发展的早期（良性），中期及晚期（攻击性与侵袭性）阶段的小鼠卵巢表面的上皮细胞显示越来越多的糖酵解表型。该表型证实了卵巢癌的发生发展与糖酵解途径存在相关关系［7－8］。基于葡萄糖在卵巢癌细胞生长中的作用仍然知之甚少，本研究旨在测试葡萄糖对卵巢癌细胞的细胞生长增殖的影响。

1材料与方法

1．1细胞系

人卵巢癌细胞系SKOV3与A2780均由山东大学附属山东省肿瘤医院基础实验室提供。

1．2主要试剂与仪器RPMI

1640、DMEM／F12培养基以及胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）均购自美国Gibco公司，四甲基偶氮唑蓝（methylthiazolyltetrazolium，MTT）、N，N，N′，N′－四甲基乙二胺（N，N，N′，N′－Tetrameth－ylethylenediamine）购自美国Sigma公司，二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）购自中国碧云天公司，AnnexinⅤ／FITC细胞凋亡试剂盒购自美国BD公司。SpectraMaxi3型荧光酶标仪购自德国MolecularDevices公司，FACSCalibur型流式分析仪购自美国BD公司。

1．3方法

1．3．1实验分组

根据参考文献［9］及预实验，选定0、2．5、5．5和25．0mmol／L葡萄糖浓度进行分组，分别代表无糖、低血糖、正常血糖浓度及高血糖浓度的环境。

1．3．2人卵巢癌细胞的培养

A2780细胞与SK－OV3细胞分别选用含质量分数为10％FBS的RPMI1640与含质量分数为10％FBS的DMEM／F12培养基进行培养；培养基中加入质量分数为1％的抗生素。将细胞转至37℃、5％CO2的培养箱内进行培育。

1．3．3MTT法细胞增殖检测

分别选取生长状态良好的SKOV3和A2780细胞制成单细胞悬液，根据细胞特性不同，将每种细胞约4000个／孔接种在含有其相应培养基的96孔板中。24h后，将细胞在对应不同刺激条件的培养基中继续培养48h。加入5μL／孔MTT溶液（5mg／mL），继续培养1h后吸走孔内液体，向每孔加入100μLDMSO终止MTT反应。最终通过测定在570nm波长下吸光度值检测细胞活性。每个试验依据上述步骤至少重复3次。

1．3．4PI染色法检测细胞周期

使用碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色法评估各组葡萄糖对SK－OV3与A2780细胞周期的作用，由20μg／mLPI＋200μg／mLRNaseA＋0．1％TritonX－100配制。以1．0×106mL－1铺种到培养皿，过夜待细胞贴壁后，更换各组培养基。胰酶消化后使用冷PBS洗涤1～2次。室温下1200r／min离心5min（r＝11．5cm），去除上层的液体，加入预冷的体积分数为70％乙醇5mL悬浮固定细胞，密封，4℃放置24～72h。固定后室温下1200r／min离心5min（r＝11．5cm），去除上层液体。使用1mL预冷磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline，PBS）洗涤2遍后1200r／min离心5min（r＝11．5cm）并去除上清，加入一定量的PI（200～400μL）染液。使用流式细胞分析仪评估处于各个周期阶段的细胞数。本试验依照上述步骤至少重复3次。

1．3．5细胞凋亡检测

使用AnnexinⅤFITC试剂盒检测AnnexinⅤ的表达。将细胞以1．0×106mL－1接种在培养皿中过夜培养，在上述糖浓度下培养24h。收集细胞后用PBS洗涤，将细胞置于避光条件下置于含有AnnexinⅤ与PI双染色溶液（0．1μgAnnexinⅤFITC＋1μgPI）的100μLbinding悬浮15min，并最终通过流式细胞仪检测。本试验依照上述步骤至少重复3次。

1．4统计学方法

利用GraphpadPrism6．0对所有据进行统计的分析，计量资料以x－±s表示，组间比较采用t检验。当比较两组之间的均数差异时，使用t检验，当≥3个样本时，使用方差分析。检验水准α＝0．05。

2结果

2．1高糖促进卵巢癌细胞的增殖

根据上述糖浓度培养卵巢癌细胞48h，通过MTT检测发现，随着葡萄糖浓度增加，细胞增殖的相对百分比升高。SKOV3细胞高糖组较无糖组细胞增殖约（1．942±0．086）倍，t＝20．77，P＝0．0002；与低糖组比较，细胞增殖幅度自（1．161±0．117）倍变为（1．942±0．086）倍，t＝7．949，P＝0．004；A2780细胞高糖组与无糖组相比，增殖约（1．841±0．157）倍，差异均有统计学意义（t＝4．193，P＝0．002），说明低糖条件抑制卵巢癌细胞生长，高糖条件促进卵巢癌细胞生长。

2．2低糖诱导卵巢癌细胞G1阻滞

使用不同葡萄糖浓度培养细胞24h之后，与高糖组相比，低糖组细胞处于G0／G1期的百分比相对增多，随着糖浓度减低，SKOV3细胞处于G0／G1的百分比依次为（40．699±1．131）％、（43．243±1．577）％、（44．846±1．768）％和（58．169±2．643）％，A2780细胞分别为（46．348±2．150）％、（50．875±8．598）％、（52．911±6．793）％和（54．770±2．475）％。SKOV3与A2780卵巢癌细胞高糖组（t＝8．888，P＝0．012）与无糖组（t＝5．358，P＝0．031）比较，差异均有统计学意义。2．3低糖诱导卵巢癌细胞的凋亡图3示，采用AnnexinⅤ／PI法评估细胞凋亡数目，将细胞在上述糖浓度中培养24h，高糖组、正常糖组、低糖组与无糖组中，SKOV3细胞发生凋亡的比例依次为（3．980±0．962）％、（6．618±0．632）％、（11．000±0．778）％和（14．015±0．827）％。低糖组与正常糖组相比差异有统计学意义，t＝7．013，P＝0．006；低糖组与高糖组比较，差异有统计学意义，t＝8．027，P＝0．015。A2780细胞中发生凋亡的细胞比例依次为（3．745±0．686）％、（4．490±0．198）％、（5．538±0．921）％和（12．930±1．127）％，无糖组与高糖组相比差异有统计学意义，t＝8．984，P＝0．012。

3讨论

正常细胞癌变时，其葡萄糖代谢将从氧化磷酸化状态转化为有氧糖酵解。肿瘤细胞通过新陈代谢提供其生长与分裂所需的生物合成，并且维持其自身于较低水平的氧化（还原）稳态。即使处于丰富的氧含量条件中，其能量产生优先依赖于糖酵解。虽然糖酵解途径中的三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）的净产率不及氧化磷酸化途径，但是肿瘤细胞通过提高葡萄糖摄取率这一特点，反过来促进更高速率的糖酵解效应进行［10］。因此，肿瘤细胞具有更高的能量消耗比率，其生长与合成对葡萄糖呈高度依赖性。本研究结果显示，给予不同葡萄糖浓度培养48h后，随着糖浓度增高，SKOV3与A2780卵巢癌细胞增殖为1．841～1．942倍，表明高葡萄糖浓度通过促进癌细胞产生ATP及其他生物前体的合成，为癌细胞生长提供足够的能量，从而快速促进卵巢癌细胞增殖。

在低糖与无糖条件刺激下，大多数肿瘤细胞通过诱导凋亡、应激以及细胞周期阻滞，最终导致细胞死亡［11－12］。为进一步探讨低糖与无糖条件对卵巢癌细胞周期的影响，本研究通过体外设立4组葡萄糖浓度，模拟人体不同生理状态的血糖水平［9］，结果显示，通过对SKOV3与A2780卵巢癌细胞进行上述干预后，癌细胞发生G1期阻滞，阻碍了针对其细胞分裂所进行的生物合成，如RNA、蛋白质及其他生物前体，从而抑制细胞分裂、增殖。AnnexinⅤ作为一种磷脂结合蛋白，其通过磷脂酰丝氨酸与早期凋亡细胞的胞膜结合，故常作为检测早期凋亡细胞的灵敏指标。

本研究中，在低糖或无糖条件刺激下，卵巢癌细胞凋亡比例为5．538％～14．015％，高糖组细胞凋亡比例为3．745％～3．980％，表明葡萄糖减低时，可能通过阻断糖酵解导致ATP能量缺失而引发线粒体损伤，线粒体内、外膜之间的通透性转换孔开放，释放细胞凋亡启动因子，引发细胞凋亡。由此可以认为，低糖或无糖刺激抑制卵巢癌细胞增殖，可归因于诱导其细胞周期G1期阻滞并卵巢癌细胞凋亡。综上所述，本研究通过探讨葡萄糖对卵巢癌细胞生长与增殖的影响，证明低糖与无糖条件诱导细胞发生G1期阻滞、细胞凋亡并抑制其增殖。因此，若进一步给予相应抑制剂干预，有可能为卵巢癌的临床治疗提供新思路，这需要更深入的研究。

参考文献：

［12］谢泽君，唐玥，周静，等．二甲双胍联合2－脱氧－D－葡萄糖对肝癌细胞增殖与凋亡的影响及其机制［J］．国际肿瘤学杂志，2017，44（2）：81－84．

作者：尹雅洁1，2;盛修贵2，3;王兴武2，4;高楠1，2;王菲1，2;邓祥云1，2 单位：1．济南大学•山东省医学科学院.医学与生命科学学院，2.山东大学附属山东省肿瘤医院妇瘤科，3．中国医学科学院肿瘤医院深圳医院妇瘤科，4．山东大学附属山东省肿瘤医院基础实验室