鼻腔鼻窦鳞状癌细胞研究范文

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［摘要］目的探讨促肝细胞再生磷酸酶－3（PRL－3）在鼻腔鼻窦鳞状细胞癌（SNSCC）中表达的临床意义。方法采用免疫组织化学及逆转录PCR（RT－PCR）方法检测62例SNSCC组织（SNSCC组）中PRL－3蛋白的表达水平，并对30例鼻息肉患者（NP组），以及25例正常鼻腔黏膜（对照组）做相同蛋白表达并进行对比。结果在蛋白水平和基因水平检测，均发现SNSCC组中PRL－3的表达高于NP组及对照组，差异有统计学意义（P＜0．05）。PRL－3的表达情况在不同的性别、年龄中差异无统计学意义（P＞0．05），而随着TNM分期的增高，分化程度的降低及合并淋巴结转移，PRL－3的表达明显增高（P＜0．05）。结论PRL－3的表达可以对SNSCC的增殖活性作很好的参照，表达强度可明显反映SNSCC细胞增殖活性，PRL－3可能是SNSCC的一个独立预后指标，提示预后不良。

［关键词］鼻腔；鼻窦；癌，鳞状细胞；促肝细胞再生磷酸酶－3

促肝细胞再生磷酸酶－3（PRL－3）属于酪氨酸蛋白磷酸酶，它是目前发现的与恶性肿瘤细胞的转移相关的一个重要基因，它可以促进恶性肿瘤细胞的增殖黏附及迁移［1］。目前，鲜见PRL－3在鼻腔鼻窦鳞状细胞癌（SNSCC）中的表达及意义的报道，其与SNSCC的生长、浸润和转移关系尚待研究。本研究就采用免疫组织化学及逆转录PCR（RT－PCR）的方法检测PRL－3在SNSCC中的表达情况，分析PRL－3与SNSCC临床病理特征的关系，探讨PRL－3与SNSCC分化、转移及预后之间的关系，为临床早期诊断SNSCC提供参考。

1资料与方法

1．1一般资料

收集本院2007年12月至2014年12月手术切除或活检的62例SNSCC组织（SNSCC组），30例鼻息肉（NP组）和25例接受中鼻甲部分切除术患者的切除中鼻甲黏膜组织（对照组）。其中，SNSCC组男39例，女23例，年龄32～77岁；NP组男19例，女11例，年龄16～70岁；对照组男13例，女12例，年龄18～53岁。SNSCC组均未接受任何的放化疗或免疫治疗。所有标本取材后平分为两份，一份送病理科做成石蜡块，另一份放入液氮中冰冻保存。

1．2方法

1．2．1主要试剂

鼠抗人PRL－3单克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司；羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）／辣根酶标记二抗和二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Trizol、逆转录试剂盒购自Takara公司；PCR引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司；50bpDNALadder购自北京天根生化有限公司。

1．2．2免疫组织化学（SP法）检测PRL－3的表达

取包埋石蜡块、4μm连续切片。按SP法试剂盒操作规程说明书进行免疫组织化学染色，切片常规脱蜡、水化，进行抗原修复，经DAB显色，苏木素复染后，脱水、封片。用已知阳性标本阳性对照，磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗做阴性对照。结果判定：PRL－3阳性表达为在细胞膜及膜周细胞质中出现棕黄色颗粒，每张切片取5～8个高倍视野进行观察，每个视野的细胞计数为100个，取平均数，根据阳性细胞百分比来对PRL－3阳性细胞数进行判断，≤25％为（－），＞25％～＜51％为（＋），51％～75％为（＋＋），＞75％为（＋＋＋）。

1．2．3RT－PCR法检测PRL－3的表达

冻存的SNSCC标本按Trizol一步法，提取总RNA，将2μg总RNA为模板逆转录为cDNA，以cDNA产物为模板，PRL－3和GAPDH为引物，行PCR扩增。根据已知PRL－3基因序列，上游引物序列：5′－GGGACTTCTCAGGTCGTGTC－3′，下游引物序列5′－AGCCCCGTACTTCTTCAGGT－3′。β－actin上游引物序列5′－AGCGAGCATCCCCCAAAGTT－3′，下游引物序列5′－GGGCACGAAGGCTCATCATT－3′。严格按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行操作，荧光定量PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环。72℃终延伸10min，取PCR产物行质量分数1％琼脂糖凝胶电泳分析，经溴化乙锭显影后，凝胶成像系统成像，并进行光密度半定量分析。目的基因的相对表达量以目的条带积分光密度（OD）值与内参照条带OD值的比值表示。

1．3统计学处理

采用SPSS13．0进行描述分析，计量资料用x±s表示，组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间采用χ2检验（必要时用Fisher精确法）等级资料两组间比较用Wilc－oxon秩和检验。检验水准α＝0．05，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1PRL－3蛋白在3组患者标本组织中的表达情况

PRL－3蛋白在SNSCC组（75．81％）中的表达显著高于在对照组（20．00％）及NP组（40．00％）中的表达，差异有统计学意义（P＜0．05）。

2．2PRL－3蛋白在SNSCC组织中的表达与临床病理特征的关系

PRL－3蛋白在SNSCC中的表达与病理分期、分化程度及合并淋巴结转移有关（P＜0．05），与性别、年龄无关（P＞0．05）。

2．3RT－PCR法检测PRL－3蛋白在3组组织中的表达

SNSCC组中的PRL－3mRNA相对表达量（0．89±0．09）明显高于NP组（0．57±0．06）及对照组（0．21±0．02）（P＜0．05）。RT－PCR反应后电泳结果。

3讨论

PRLs属于一类酪氨酸蛋白磷酸酶，其家族包含3个亚型，即PRL－1、PRL－2和PRL－3。而其中以PRL－3在肿瘤中的生物活性最显著。PRL－3位于染色体8q24．3上，含有PTP催化位点序列，其编码蛋白产物含有一个保守的C－末端半胱氨酸CAAX残基－异戊烯化结构域，此结构域内的Cys104和Arg110保守催化残基与PRL－3的酶活性有关。PRL－3蛋白在人的骨骼肌、胰腺组织及心肌细胞中有不同程度的表达，而脑肺肝肾等组织鲜有表达。它具有促进细胞生长和增殖，增强恶性细胞迁移和浸润能力，还有促进细胞恶化及转移等多种功能［4－7］，具体作用机制包括以下几点：（1）PRL－3可通过激活Rho信号转导途径，调控肿瘤细胞的侵袭和活动性，促进肿瘤细胞的增殖及转移；（2）PRL－3可通过介导ERK信号传导通路，促进肿瘤血管的生成，从而促进肿瘤的生长及成熟，促进淋巴结转移及远处转移；（3）PRL－3可通过诱导促进血管内皮生长因子（VEGF）及其受体的过度表达，促进肿瘤的生长、侵袭及转移；（4）PRL－3还可通过调节其他癌症相关基因的表达来介导肿瘤的侵袭、转移；（5）PRL－3通过正调控PI3K细胞通路，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞分裂增殖，诱导肿瘤细胞生长。此外，PRL－3还可通过调节PI3K通路促进肿瘤的侵袭及转移；（6）PRL－3可促进转移性肿瘤的形成。

本研究显示，SNSCC组织中的PRL－3的表达明显高于NP组织及正常鼻腔黏膜组织，而且与SNSCC的TNM分期、分化程度及淋巴结转移密切相关。此结果提示在SNSCC的发生、发展及转移过程中PRL－3可能发挥了重要的作用。因此，检测PRL－3可能对早期发现SNSCC具有重要的临床意义，同时，对SNSCC生物学行为、预后具有重要意义，有可能成为SNSCC治疗的靶点及预后标记物。本研究对PRL－3高表达与SNSCC的发生、发展及转移的关系在分子水平上提供了一些理论基础，但其具体作用机制，尤其是PRL－3通过何途径促进SNSCC转移的，仍需进一步探讨。

参考文献

［1］孙振华，卜平．胃癌PRL－3与Bmi－1mRNA联合表达的定量分析及其意义［J］．广东医学，2012，33（7）：987－989．

［2］郭延林，朱彦君，伍青．PRL的生物学功能及与肿瘤关系的研究进展［J］．现代肿瘤医学，2013，21（3）：659－662．

作者：陆鸿略1，马桂琴1，岳卓立1，康菲2 单位：承德医学院附属医院：1．耳鼻咽喉科；2．体检科