大肠癌细胞生长的影响机制范文

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【摘要】

目的探讨VEGF对大肠癌细胞生长的影响机制研究。方法采用基因芯片方法，筛选大肠癌的相关因子。采用免疫组化方法检测大肠癌组织、癌旁组织和正常组织中VEGF的表达。采用免疫荧光方法检测三种组织内淋巴管和血管中VEGF的表达。结果基因芯片筛选结果显示VEGF在大肠癌组织中呈高表达。免疫组化结果显示22例大肠癌组织中VEGF呈高表达，与正常组织比较，具有统计学意义，P＜0．05。免疫荧光检测结果显示在癌组织中呈高表达VEGF时其淋巴管和血管内均增高(相比于正常组时)，且有统计学差异，(分别为P＜0．001和P＜0．05)，在癌旁组织中VEGF呈低表达(相比于癌组织)时相对癌组织，淋巴管和血管内均降低，且有统计学差异(分别为P＜0．001和P＜0．05)。结论VEGF可以通过调节淋巴内皮细胞进行促进大肠癌细胞的生长。

【关键词】

血管表皮生长因子;肠癌;淋巴管

在西方国家中，结肠癌在肿瘤疾病中处于第二难治愈肿瘤。结直肠癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中上升至第三位，我国和全世界范围的发病率和死亡率仍处于上升趋势［1］。尽管预防措施和治疗手段不断改进，但转移患者5年的生存率低于10%［2-3］，及时控制肿瘤的发生发展和抑制转移是提高生存率的有效手段。它的扩散有很多方式，淋巴管的浸润和转移是其最为常见的方式［4-5］。表皮生长因子刺激增殖，促进淋巴管的生成和血管新生。据研究表明，VEGF在肿瘤组织中的表达和淋巴结的转移呈正相关，早期的研究表明VEGF家族和其受体在肠癌中会引起肠癌细胞的浸润，而且有人证实VEGF的高表达是促进了其肿瘤相关的淋巴管扩张，因此在肠癌转移抑制淋巴管的生成中成为一个很有效的方式［6］。所以我们需要证实在肠癌中是否VEGF会引起淋巴管和血管的变化，进而引起肠道肿瘤的变化，因此我们对此展开研究。

1材料与方法

1．1临床资料收集我院普外科大肠癌患者样本22例，男性13例，女性9例，年龄35～78岁，平均(55．3±9．8)岁，高分化腺癌6例，中分化腺癌12例，低分化腺癌4例。分别取肿瘤组织相对应的癌旁组织和正常组织作为对照，检测VEGF的表达水平。

1．2方法

1．2．1RT-PCR试剂及方法逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，称取等量组织或血清，加入同等比例的Trizol，12000r/min，4℃离心10min;吸取上清液至一新的EP管中，静置5min，使之充分裂解;加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，然后放置3min;12000r/min，4℃离心15min，离完后分为3层，取最上层(中间一层为蛋白)至一新的EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒数次，室温沉淀10min;12000r/min，4℃离心10min，弃上清液;加入75%乙醇(DEPC水溶解)，颠倒数次混匀;7500r/min，4℃5min，弃上清液，小心吸尽液体(此时可以看到白色沉淀即为RNA);RNA略干后加入20μLDEPC水。采用(Ambion公司)小分子分离试剂盒分理处小分子RNA，基因芯片购自于AffymetrixHumanGeome公司。

1．2．2免疫组化［7］①脱蜡:按照常规脱蜡方法，在二甲苯，无水乙醇，95%乙醇，90%乙醇，85%乙醇，80乙醇脱蜡，大约每次时间为10min。②抗原修复:PBS洗后，加入3%H2O2，37℃浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，PBS洗，再加入柠檬酸缓冲液，高温高压修复5min，冷却至室温。③血清封闭:PBS洗，5min，洗3次，擦干组织周围的PBS液，然后10%BSA封闭，放入37℃温箱中1小时。④加一抗:将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，加完一抗(VEGF，购自于santa)后于4℃冰箱中保存过夜。⑤加二抗:将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗，然后置于37℃温箱中1h。⑥加显色剂:将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上DAB显色剂。

1．2．3免疫荧光染色组织经过固定后，蔗糖梯度脱水，冰冻切片，切片厚度为6μm，高温修复5min，待其冷却后，PBS洗涤(3次，每次5min)，10%BSA封闭50min，然后进行一抗染色，过夜，第二天复温40min，PBS洗涤(3次，每次5min)，然后进行荧光二抗染色，一抗为VEGF(抗兔)，购自于santa，1∶100，标记血管内皮细胞，LYVE-1(抗羊)，购自于santa1∶100，二抗分别选用，抗兔(595nm)，抗山羊(488nm)。

1．3统计学处理应用SPSS11．0统计软件包处理，统计学方法采用t检验，Pearson相关分析，χ2检验，P＜0．05为差异具有统计学意义。

2结果

2．1血管表皮生长因子在大肠癌组织中呈高表达研究发现所提取的RNA纯度较高，且未出现降解等情况。采取28s和18s的比例，28s和18s是真核生物rRNA(核糖体RNA)的两个主要亚基，在体内含量较多。28s/18s即为衡量提取的RNA完整性的指标，如果28s/18s为1．8～2．0表明所提取RNA完整性较好，基本无降解发生。电泳条带上应是28s在上，18s在下，且亮度为28s是18s的两倍，见图1。将正常组织和大肠癌组织进行基因芯片的筛选，在筛选中我们发现VEGF在大肠癌组织中呈高表达，见图2。

2．2大肠癌组织和正常组织中VEGF的表达(图3)结果发现，22例大肠癌组织中VEGF呈高表达，与正常组织比较，具有统计学意义，P＜0．05。

2．3不同组织中VEGF的检测分别检测正常组织、癌旁组织和大肠癌组织中的VEGF表达量，结果发现在癌组织中VEGF呈高表达时其淋巴管和血管内表达水平均增高(相比于正常组织时)，且有统计学差异(分别为P＜0．001和P＜0．05)，在癌旁组织中VEGF呈低表达(相比于癌组织)时相对癌组织，淋巴管和血管内其表达水平均降低，且有统计学差异(分别为P＜0．001和P＜0．05)，见图4。

3讨论

大肠癌是人类疾病中恶性程度较高的一类疾病，其主要特点是易发生转移，特别是淋巴结的转移。转移的肿瘤通过血液，淋巴管，进而形成多种其他肿瘤，淋巴管的转移包括一系列的复杂过程，包括，①原位癌恶性肿瘤细胞扩散至旁边淋巴管;②肿瘤细胞通过淋巴管转运至邻近的淋巴结;③肿瘤细胞在淋巴结中的着落;④转移性的肿瘤在淋巴结中的扩散［8］。在最近的研究多集中在VEGF家族在大肠癌中的作用，特别是VEGF-C，VEGF-C是在1996年从人前列腺癌PC-3细胞株中分离出来，其位于染色体4q34，在其编码外端有7个外显子，是人类第一格发现的具有促进淋巴管生成的基因［9-10］。VEGF具有诱导淋巴管生成和血管新生的潜能，且能调节生理性的和病理性的血管新生，因此VEGF在肿瘤发生发展和生长中发挥着重要作用［11］。VEGF主要在血管中表达，它的主要作用就是集中在促进血管新生方面，在肿瘤区域，血管新生是肿瘤发生发展的一个重要原因，所以研究VEGF在肠癌中的研究就显得尤为重要。基于此本研究展开在大肠癌中进行VEGF的研究，检测结果发现癌组织中高表达VEGF时其淋巴管和血管内均增高(相比于正常组时)，且有统计学差异，(分别为P＜0．001和P＜0．05)，为了证实这种结果是VEGF造成的，我们看到在癌旁组织中VEGF低表达(相比于癌组织)，果然在低表达VEGF时其相对癌组织，淋巴管和血管内均降低，所以我们得出结果VEGF可以通过调节淋巴内皮细胞进行促进大肠癌细胞的生长。

通过本研究其很多同仁的研究必将更加证实VEGF与大肠癌细胞生长的关系，笔者认为在今后研究愈加深入后VEGF极有可能成为抑制大肠癌细胞生长的靶向药物。

作者：王益 张晶 刘蓓 单位：武汉科技大学附属天佑医院