人卵巢癌细胞的体外抑制范文

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摘要：

［目的］研究二去水卫矛醇对人卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖的抑制作用。［方法］采用噻唑蓝（MTT）比色法和CCK－8（cellcountingkit－8）法检测不同浓度DAG对人卵巢癌细胞A2780和SKOV3的体外抑制作用，观察DAG的半数抑制浓度。［结果］MTT法检测结果显示，DAG对人卵巢癌细胞A2780、SKOV3作用72h后半数抑制浓度（72h－IC50）分别为19．97μg／ml、22．57μg／ml；而CCK－8法检测结果显示，DAG对人卵巢癌细胞A2780、SKOV3作用72h后72h－IC50分别为15．15μg／ml、16．15μg／ml。显微镜下可见DAG72h作用后细胞圆缩、胞质浓缩、胞浆内颗粒集中边缘化甚至细胞溶解等损伤现象。［结论］DAG在体外对人卵巢癌细胞A2780和SKOV3均有抑制生长作用。

关键词：

二去水卫矛醇；人卵巢癌细胞；噻唑蓝试验；CCK－8法；半数抑制浓度

二去水卫矛醇是以从卫矛科植物蜜花美登木中分离出的卫矛醇［1］为原料，经溴化、消除反应而制得的1，6－二溴卫矛醇（1，6－dibromidulcitol）的双环氧化物，是新型的植物生物碱类抗肿瘤药，它与烷化剂形成交叉耐药，结构上可归为烷化剂类，为广谱抗肿瘤药物，具有毒性小、易溶于水、抗肿瘤活性高等优点。早期临床试验表明，DAG对慢性粒细胞白血病、肺癌、原发性脑瘤、人胃癌细胞、人鼻咽癌细胞、人肺癌细胞、肾上腺肿瘤、膀胱癌、胃肠道肿瘤实体瘤等均有抑制作用［2－7］。另外，还有研究表明DAG是周期非特异性药物，它可以与某些周期特异性药产生协同作用［8］。而DAG对人卵巢癌抑制作用及分子机制的研究在国内外尚未见详尽报道。为此，本实验通过噻唑蓝（MTT）比色法和CCK－8法检测DAG对人卵巢癌的体外抗肿瘤活性，为扩大其抗瘤谱及进一步进行结构改造、分子机制研究提供依据。

1材料与方法

1．1药物与细胞株二去水卫矛醇由广西梧州制药（集团）股份有限公司提供，临用前用完全培养基液配成所需浓度；RPMI1640、胎牛血清（FBS）、0．25％胰蛋白酶溶液均购于赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS，0．01mol／L）是福州迈新生物技术开发有限公司产品；青链霉素混合液（100U／ml）和噻唑蓝（MTT）均是北京索莱宝科技有限公司产品；CCK－8溶液是上海尚宝科技有限公司产品；人卵巢癌细胞A2780和SKOV3购自中科院上海细胞库。

1．2主要仪器设备CO2培养箱；酶标仪；倒置显微镜（重庆光学仪器厂出品）。

1．3细胞的培养先配好含10％胎牛血清和青链霉素混合液（终浓度为青霉素100IU／ml，链霉素100μg／ml）的RPMI1640完全培养液，然后用此完全培养液于37℃、5％CO2培养箱中培养人卵巢癌细胞A2780和SKOV3，细胞贴壁生长，隔天换液，待细胞长至覆盖瓶底的80％左右时，用0．25％胰蛋白酶溶液消化传代。取状态良好的长至对数生长期的细胞用于后续细胞增殖抑制实验。

1．4MTT试验方法收集对数生长期的A2780和SKOV3细胞，调整细胞密度，以每孔100μl、5×103个细胞接种于96孔板里，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，以细胞培养基为空白对照，A2780、SKOV3细胞的其他组分别加入6μg／ml、12μg／ml、24μg／ml、48μg／ml、96μg／mlDAG完全培养液100μl，同时每组设5个复孔，处理完后置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养72h后，倒置显微镜下观察细胞形态，并于每孔中加入20μl的MTT溶液，放入CO2培养箱中继续培养4h，弃去培养液，每孔加入150μlDMSO溶液显色，振荡10min，使孔内溶液颜色均匀，于570nm波长酶标仪测定吸光度值（OD）。实验重复3次，取平均值为最终结果。按下式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率＝1－实验组平均OD值／空白对照组平均OD值×100％，计算细胞生长抑制达50％的DAG浓度，以72h－IC50表示。

1．5CCK－8试验方法细胞处理情况与MTT法相似，待培养细胞，给药处理72h后，同样于倒置显微镜下观察细胞形态，将每孔培养液混合均匀，吸出100μl弃去，并于每孔中加入10μl的CCK－8溶液，放入CO2培养箱中继续培养，待1．5h后观察显色情况，于450nm波长酶标仪测定吸光度值（OD）。实验重复3次，取平均值为最终结果，计算细胞增殖抑制率。

2结果与分析

2．1两种方法测定结果MTT法测定不同浓度DAG对A2780及SKOV3细胞作用72h后的OD值及细胞增殖抑制率见表1，CCK－8法测定不同浓度DAG对A2780及SKOV3细胞作用72h后的OD值及细胞增殖抑制率见表2。通过SPSS19．0软件计算DAG对两种细胞的半数抑制浓度（IC50）值。表1、表2结果看出，经不同浓度DAG作用72h后，上述实验组的OD值与空白对照组相比均呈下降趋势，且有明显的浓度－效应关系。说明DAG对以上两株人卵巢癌细胞均有抑制生长作用。两种测定方法的结果显示，CCK－8法的灵敏度和准确度较高，且重复性优于MTT法。

2．2细胞形态观察结果DAG作用于A2780和SKOV3细胞72h后，在倒置显微镜下观察，各实验组细胞均不同程度出现贴壁能力减弱、细胞圆缩、胞质浓缩、胞浆内颗粒集中边缘化甚至细胞溶解等损伤现象，而空白对照组细胞均生长良好，细胞形态完整，胞质透亮。

3结论

本文初步探讨了DAG对人卵巢癌细胞的体外抑制作用，结果表明，DAG对A2780、SKOV3两株人卵巢癌细胞均有抑制生长作用，且具有明显的浓度－效应关系。但DAG诱导人卵巢癌细胞凋亡所发生的基因、蛋白表达谱变化，体内抑制人卵巢癌效果等有待于下一步深入研究，以便于发现新的作用靶点，对其进行相应的结构改造，开发抗肿瘤靶向制剂。

作者：周莹 刘华钢 苏桂玉 彭晓丽 单位：广西医科大学 广西中医药大学