前列腺癌细胞系中转移相关基因范文

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【摘要】

目的：通过基因芯片技术检测具有不同转移潜能的前列腺癌细胞系LNCaP和C4－2中表达差异的基因，寻找前列腺癌转移相关基因。方法：采用TRIzol一步法提取LNCaP和C4－2细胞的总RNA，并纯化mRNA，反转录合成荧光分子标记的cDNA探针，与基因芯片杂交。采用GenepixPro6．0图像分析软件进行芯片图像分析，把图像信号转化为数字信号，然后以差异大于等于2倍的标准来确定差异表达基因。结果：在LNCaP与C4－2细胞中，表达差异的基因共有417个，上调基因301个，下调基因116个。分析显示差异表达基因分别与细胞增殖、代谢、细胞因子、细胞转移等相关，其中发现7个基因与肿瘤细胞的转移相关，分别为EGFR、EGF、PIK3R1、CyclinE、HYAL1、GNAI1、AZGP1。结论：筛选出LNCaP与C4－2细胞系中7个转移相关基因，为进一步研究前列腺癌转移机制奠定了基础。

【关键词】

基因芯片；LNCaP细胞；C4－2细胞；转移；前列腺癌

前列腺癌是男性常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤之一，在欧美国家，男性所有肿瘤中PC占了30％，病死率仅次于肺癌居第二［1］。随着我国人民生活水平的提高、生活方式的改变及男性平均寿命的延长，前列腺癌的发病率不断上升。有学者［2］在1941年发现前列腺癌是一种雄激素依赖的恶性肿瘤，雄激素通过与前列腺癌细胞的雄激素受体（androgenreceptor，AR）结合激活下游的分子信号通路，促进前列腺癌增殖。抗雄激素治疗可延缓前列腺癌的进展，改善患者生活质量［3］。因此，手术及药物去势等雄激素剥夺相关的内分泌治疗对前列腺癌患者有显著疗效。然而，约90％的前列腺癌患者在接受雄激素剥夺治疗12～24个月后会对内分泌治疗发生抵抗，进展为雄激素非依赖的去势抵抗型前列腺癌，肿瘤进展加快，发生远处转移，因缺乏有效的治疗措施最终导致患者死亡［4－5］。目前有效控制肿瘤的进展，防止肿瘤发生远处转移是前列腺癌研究领域的热点，因此，明确前列腺癌转移的分子机制，寻找有效的治疗靶点，对前列腺癌的治疗尤为迫切。本研究通过基因芯片技术，寻找具有低转移潜能的前列腺癌细胞LNCaP及其衍生的雄激素非依赖的转移细胞系C4－2间表达差异的基因，并分析与转移相关的差异基因，为探索前列腺癌转移相关分子机制提供一定的线索和研究基础。

1材料与方法

1．1材料前列腺癌细胞系LNCaP、C4－2购自上海细胞库；人类全基因组芯片购自Agilent公司；胎牛血清购自Hyclone公司；TRIzol购于Invitrogen公司，RNA反转录试剂购自TaKaRa公司；总RNA的纯化试剂盒及cRNA纯化试剂盒购自QIAGEN公司；基因表达杂交试剂盒（货号5188－4242），RNASpikeInKit试剂盒（货号：5188－5282）购自Agilent公司。

1．2细胞培养与总RNA提取及纯化LNCaP、C4－2前列腺癌细胞用含100ml／L胎牛血清的1640培养基，置于37℃、50ml／LCO2培养箱中培养。细胞汇合度达到80％～90％融合后，PBS液体洗两遍，加入TRIzol反复吹打，充分裂解细胞，加入氯仿室温静置15min，4℃，12000r／min离心10min，吸取上清，加入异丙醇静置10min后，4℃，12000r／min离心10min，75％酒精洗涤沉淀，离心，室温静置5min，加入DEPC处理水溶解RNA，－70℃保存。抽提总RNA的浓度和质量采用分光光度计及琼脂糖胶电泳测定。总RNA纯化的详细步骤严格按照QIAGENRNeasyMiniKit操作。

1．3荧光标记cRNA合成及纯化严格遵循Agilent芯片表达分析实验方法进行双链cDNA的合成、荧光标记cRNA的合成以及cRNA的片段化等过程。cDNA第一链和第二链以randomPromoterprimer为引物配制cDNA合成体系运用一步法合成；cRNA以荧光染料标记后，以QIAGENRNAeasyminikit纯化cRNA，以分光光度计分析cRNA浓度（具体操作步骤详见AgilentcDNA表达谱芯片操作指南）。

1．4芯片杂交cRNA片段化后加入HybridizationBuffer混匀配制杂交液后滴加于芯片上杂交过夜。芯片杂交后的洗涤、染色过程遵照标准的Agilent表达谱芯片实验指南进行。

1．5数据分析芯片结果采用AligentScanner来获取图像，通过Imagene转化为数值后应用Genespring分析软件将数值进行标准化，取得Ratio值。一般认为Ratio值在0．5～2．0范围内的基因不存在显著的表达差异，而在该范围之外的基因被认为表达出现显著改变。因此，实验结果将两个细胞株之间差异表达平均倍数≥2．0倍或≤0．5者筛选出来，作为上调和下调的候选研究基因。对差异表达基因的分析借助于GenBank数据库、GO分析等完成。

2结果

2．1mRNA基因表达图谱分析C4－2与LNCaP细胞比较，基因表达上调2倍的mRNA基因有301个，基因下调2倍的mRNA基因有116个。芯片杂交散点图如图1所示，图中每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号，越偏离两条线的点，表示此基因在C4－2与LNCaP的差异越明显。在两条线之内或者重合的点，表示此基因在两株细胞系中无明显差异。

2．2转移相关差异表达基因分析结果结合基因芯片的结果，通过GO富集分析发现EGFR、EGF、PIK3R1、CyclinE、HYAL1、GNAI1、AZGP1可能与前列腺癌转移相关，结果见表1。

3讨论

早期前列腺癌患者的10年生存率较高，但一旦发生转移预后不佳［6］。远处转移以骨骼和淋巴结为常见，70％～80％患者最终出现骨转移。因此明确前列腺癌转移的分子机制具有重要意义。实验中我们选用前列腺癌细胞LNCaP与其转移性亚型C4－2细胞作为研究对象，二者有相同的基因背景，LNCaP是原发性前列腺癌细胞株，转移性弱，C4－2转移能力强。本研究通过基因芯片技术快速、准确地分析数以千计的基因组信息，检测表达差异的分子，寻找前列腺癌转移相关的关键分子，为前列腺癌转移的分子机制研究提供一定的理论基础。表皮生长因子（EGF）是一种细胞调节多肽。研究表明EGF具有促进细胞分裂增殖的作用。它通过靶细胞膜上的EGFR使受体酪氨酸残基磷酸化而引发细胞的增殖效应。研究显示EGFR过表达于多种肿瘤，其介导的信号传导影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、浸润转移及血管生成［7－8］，与肿瘤恶性程度、转移、放化疗敏感度下降密切相关，许多阻滞和下调EGFR的方法被用来抑制肿瘤增殖以改善预后［9］。已有研究证实EGFR过表达与前列腺癌从激素依赖性进展至激素非依赖性相关［10］。本研究中发现C4－2细胞中EGF、EGFR表达异常增高，提示EGFR信号通路在前列腺癌转移过程中可能发挥了重要的作用。PIK3R1又称p85α，有研究已证实p85α是AR异常激活和前列腺癌激素抵抗性进展所必须的［11］。CyclinE是重要的细胞周期正性调节因子，CyclinE过表达使细胞G1期进程缩短，提前进入S期，加快转换的步伐和增加轮回数，造成细胞的无限增殖－肿瘤的形成。CyclinE与肿瘤血管的生成和肿瘤的转移关系密切［12］。因此CyclinE异常表达与前列腺癌等肿瘤的发生发展密切相关，并且可能在前列腺癌的进展中发挥着重要作用。最新的研究显示G蛋白偶联受体家族成员GNAI1可以抑制肿瘤的迁移和侵袭［13］，本研究发现C4－2细胞中GNAI1低表达，提示GNAI1在前列腺癌进展过程中，其抑制肿瘤侵袭转移的功能下降，导致肿瘤发生转移。有研究显示AZGP1的表达降低与胃癌的预后不良密切相关，他们的研究表明AZGP1可以作为一个候选的抑癌基因［14］。HYAL1编码透明质酸酶在乳腺癌细胞及组织中高表达，促进肿瘤的生长、增殖、侵袭转移能力［15］。此外，透明质酸酶在胰腺癌中异常高表达预示着患者预后不良［16］。

本课题通过应用基因芯片技术，比较具有相同遗传背景而转移特性不同的两株前列腺癌细胞系中基因的表达，发现7个前列腺癌转移相关基因，并对各个基因在肿瘤转移中的研究进行了探讨，为前列腺癌转移的分子机制提供了重要的理论基础。

作者：吴磊 惠慧 雒小佳 樊利妮 王浩 王凯 单位：陕西省肿瘤医院 西安交通大学医学院第一附属医院