顺铂联合姜黄素诱导胃癌细胞凋亡研究范文

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摘要

目的：研究应用顺铂联合姜黄素对诱导胃癌细胞HGC27凋亡的影响及机制。方法：用CCK8法检测单独或联合使用不同剂量顺铂或/和姜黄素对胃癌细胞HGC27增殖的影响；用Hochest33258染色检测联合应用顺铂和姜黄素诱导胃癌细胞HGC27凋亡的发生率。用Westernblot检测细胞凋亡相关分子PARP1蛋白剪切体和DNA损伤蛋白p-γH2AX的表达变化。结果：单用顺铂可以呈剂量依赖性地促进HGC27细胞凋亡。5μmol•L-1姜黄素对HGC27细胞增殖无明显作用，10μmol•L-1姜黄素反而轻微促进HGC27细胞增殖。20、40、80μmol•L-1姜黄素对HGC27细胞的增殖抑制率分别为10.97%、15.15%、32.93%。分析联合用药组：5μmol•L-1姜黄素联合顺铂组反而促进HGC27细胞生长；10μmol•L-1姜黄素联合不同剂量顺铂和单用顺铂组比较，组间抑制率没有统计学差异（P>0.05）。20μmol•L-1姜黄素联合4、6μmol•L-1顺铂有明显的促进细胞的凋亡作用,抑制率分别为70.68%、87.30%。Hochest33258染色结果显示，联合用药组细胞凋亡小体和坏死细胞明显增多。Westernblot结果显示，在联合用药组HGC27细胞PARP1剪切体蛋白和p-γH2AX蛋白表达明显增加。结论：顺铂联合姜黄素可以促进胃癌细胞HGC27的凋亡，机制是姜黄素可以加重顺铂引起的细胞DNA双链损伤。

关键词

顺铂；姜黄素；细胞凋亡；p-γH2AX

自从Rosenberg等[1]发现顺铂的抗肿瘤活性后，铂类药物的研究得到迅速发展。铂类药物已被广泛应用于各种恶性肿瘤的临床治疗中。据统计，目前临床化疗或者联合化疗治疗恶性肿瘤的方案中有70%~80%应用到铂类药物。由于铂类药物在治疗过程中伴发严重的胃肠反应、肾毒性、耳毒性、神经毒性和耐药性等[2]，因此，如何减弱该类药物的毒副作用和增加其化疗敏感性日益受到关注。姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种植物多酚。姜黄素的抗肿瘤作用为多靶点，因而日益引起重视。姜黄素对消化系统、生殖系统的多种肿瘤等均具有一定程度的抑制作用[3]。化疗药物增敏方面，联合使用顺铂和姜黄素已用于肝癌[4]、肺癌[5]、卵巢癌[6]等研究。目前，对于顺铂联合姜黄素是否可以直接通过引起DNA双链损伤的加重而诱导胃癌HGC27细胞凋亡尚未见报道。本实验通过联合用药直接观察双链损伤的指标p-γH2AX和凋亡相关标志物PARP1蛋白剪切体的变化，初步探讨这两种药物联合作用诱导胃癌细胞HGC27凋亡的作用机制。

1材料

1.1细胞来源及培养人胃癌细胞HGC27购自中国科学院上海细胞生物研究所。细胞培养于含100μg•mL-1链霉素、100U•mL-1青霉素和10%胎牛血清的RMPI1640培养液中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2试药与仪器RMPI1640培养基（Invitrogen，美国）；胎牛血清（四季青，杭州）；青霉素（山东新华鲁抗，批号20141007）；链霉素（华北制药，批号F31121126）；顺铂注射液（江苏豪森药业股份有限公司，诺欣TM，批号140302）；姜黄素（Turmeric，原植物Curcumalon-ga，Sigma公司）；BCA（BicinchoninicAcidproteinsaykit）蛋白浓度测定试剂盒、荧光染料Hochest33258试剂盒、RIPA裂解液[50mmol•L-1Tris（pH7.4），150mmol•L-1NaCl，1%TritonX-100，0.1%十二烷基磺酸钠，1%去氧胆酸钠]；裂液、单克隆抗α-tubulin抗体、抗荧光淬灭剂（南通碧云天生物技术有限公司）；CCK-8（CellCountingKit-8）试剂盒（上海同仁化学有限公司）；抗PARP1抗体、抗p-γH2AX抗体（美国Abcam公司）；增强化学发光液（Enhancedchemi-luminescence，ECL，美国Millipore公司）；其它生化试剂均为国产分析纯。CO2恒温培养箱（美国Thermo公司）；IX-70倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；垂直电泳仪；半干式电转移装置（美国Bio-Rad公司）；酶联免疫检测仪（美国Bio-TEKInstruments公司）。

2方法

2.1CCK-8法检测顺铂和姜黄素抑制胃癌细胞HGC27增殖培养HGC27细胞：在96孔板中每孔接种5000个细胞。对细胞进行分组处理：单用顺铂组（0、2、4、6、8μmol•L-1）、单用姜黄素组（0、5、10、20、40、80μmol•L-1）、顺铂联合姜黄素组，即2、4、6、8μmol•L-1顺铂分别联合5、10、20μmol•L-1姜黄素，以上各组处理细胞24h，每孔加入CCK-8试剂10μL，37℃继续培养1.5h，在酶标仪上450nm检测吸光度A450nm。每组设3平行实验。计算药物（或药物组合）对细胞增殖的抑制率。

2.2Hochest33258染色法检测顺铂联合姜黄素诱导胃癌细胞HGC27凋亡在6孔板中接种HGC27细胞，待细胞培养至80%满6孔板孔底。分别设4组：对照组、单用4μmol•L-1顺铂组、单用20μmol•L-1姜黄素组、4μmol•L-1顺铂联合20μmol•L-1姜黄素用药组。处理HGC27细胞24h，去培养液，用甲醇室温固定30min。每孔加入Hochest33258染色液50μL。避光染色30min后，应用磷酸盐缓冲液（PBS）液洗涤3遍，加入抗荧光淬灭剂20μL，立即在荧光显微镜下观察细胞中凋亡小体的情况。

2.3免疫印迹法检测HGC27细胞凋亡相关分子的变化在培养的HGC27细胞，按照“2.2”方法分别设立对照组和处理组，处理细胞24h。用RIPA裂解液裂解细胞，4℃、12000r•min-1离心10min，取上清液，运用BCA法测定蛋白浓度。灌制12.5%分离胶的SDS-PAGE。分别按照60μg/孔的上样量，加入全蛋白，经90V稳压电泳后，运用200mA恒流半干式电转移1h，5%脱脂奶粉室温封闭膜1h，PBST液洗涤3次，孵育抗体按照α-tubulin（1∶1000）、PARP1（1∶1000）；p-γH2AX（1∶500）稀释，4℃孵育过夜，PBST液洗涤；加入1∶1000稀释的辣根过氧化酶（HRP）标记二抗，37℃孵育1h，PBST液洗涤。ECL化学发光液曝光、检测。进行灰度值比较（相对灰度值=处理组灰度值/对照组）。

2.4统计学处理运用SPSS16.0统计软件包进行分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间样本均数间采用多因数方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1顺铂和姜黄素对HGC27细胞增殖的抑制作用

3.1.1顺铂和姜黄素单独作用结果预实验分别考察4种不同浓度顺铂和5种不同浓度姜黄素组对HGC27细胞的抑制作用，由表1可见，2、4、6、8μmol•L-1顺铂可以呈剂量依赖性的抑制细胞增殖。5μmol•L-1姜黄素对HGC27细胞增殖无明显影响；10μmol•L-1姜黄素对HGC27细胞增殖反而略有促进作用；20、40、80μmol•L-1姜黄素可以不同程度地抑制HGC27细胞增殖。其中20、40μmol•L-1姜黄素组间没有差异；80μmol•L-1姜黄素有明显抑制HGC27细胞增殖的作用（见表1）。

3.1.2顺铂联合姜黄素对HGC27细胞增殖的影响联合用药结果（见表2）显示：2、4、6μmol•L-1顺铂和5μmol•L-1的姜黄素联合应用对HGC27细胞增殖的抑制率分别为17.64%、36.90%、66.29%。单用2、4、6μmol•L-1顺铂对HGC27细胞抑制率分别是34.09%、46.18%、71.55%。提示5μmol•L-1的姜黄素和顺铂联用反而抑制肿瘤细胞的凋亡。2、4、6、8μmol•L-1顺铂联合10μmol•L-1的姜黄素作用时，诱导HGC27细胞凋亡率分别为32.32%、49.00%、72.80%、86.21%，与单用顺铂组细胞凋亡率34.09%、46.18%、71.55%、86.21%相接近，两组间抑制率没有统计学差异（P>0.05）。当4、6μmol•L-1的顺铂联合20μmol•L-1的姜黄素作用时，诱导细胞凋亡率为70.68%、87.30%，显著高于单用顺铂的凋亡率，P<0.05，差异具有统计学意义（见表2）。

3.2顺铂联合姜黄素对HGC27细胞凋亡的影响联合用药作用于HGC27细胞24h后，经Hochest33258染色，并计数500个细胞中凋亡细胞的个数，折算凋亡率（每组3平行）。结果显示，单用顺铂可以引起细胞凋亡（图1-B），其凋亡率为23.2%；20μmol•L-1姜黄素可以诱导少量细胞凋亡（图1-C），凋亡率为5.71%；联合应用顺铂和姜黄素作用于HGC27细胞组发生的凋亡最明显（图1-D），其凋亡率为35.60%，显著高于单用顺铂组和单用姜黄素处理组（图2）（P<0.05）。

3.3免疫印迹法检测HGC27细胞在凋亡过程中相关因子的变化运用Westernblot法检测单用4μmol•L-1顺铂、单用20μmol•L-1姜黄素和顺铂联合姜黄素作用24h，HGC27细胞内DNA双链损伤分子标志物p-γH2AX和凋亡蛋白PARP1剪切体的表达水平。结果显示，单用4μmol•L-1顺铂和20μmol•L-1姜黄素均可以引起p-γH2AX表达增加，其相对灰度值分别为：6.70和3.7；联合用药组p-γH2AX表达增加最明显，其相对灰度值为8.52。单用顺铂和姜黄素也可以诱导HGC27细胞中PARP1蛋白的剪切体表达，其相对灰度值分别为5.32和3.27。联合用药组中，细胞内PARP1蛋白的剪切体表达增加最明显，其相对灰度值为6.27。与单用顺铂组比较，联合用药组p-γH2AX和PARP1剪切体均显著增加（P<0.05），提示姜黄素可促进顺铂诱导的HGC27细胞DNA损伤和凋亡（图3、图4）。

4讨论

我国胃癌的发病率占所有恶性肿瘤的第四位，死亡率占第二位。作为一线化疗药物，顺铂被广泛用于胃癌等实体瘤治疗中。顺铂主要通过主动运输形式进入细胞，与DNA嘌呤形成链内交联或链间交联，导致DNA双链损伤，引发细胞凋亡[7]，DNA损伤可激活PARP1蛋白，从而杀伤肿瘤细胞[7]。但是，应用顺铂治疗的同时会引发多种副作用和产生药物耐药性。如何降低铂类药物的耐药性，增加机体药物敏感性，愈来愈受到人们重视。将中药提取单体姜黄素联合顺铂用于诱导HGC27细胞DNA损伤和凋亡，结果显示，顺铂可以浓度依赖性诱导胃癌细胞凋亡；而姜黄素只有当浓度达20μmol•L-1时才有诱导HGC27细胞凋亡的作用。所以，最终选择4μmol•L-1顺铂和20μmol•L-1姜黄素用于观察其联合作用，其抑制率是单用4μmol•L-1顺铂的1.53倍，明显提高HGC27增殖抑制和诱导凋亡的效果。DNA双链损伤的早期反应是使组蛋白γH2AX蛋白的羧基末端磷酸化，γH2AX蛋白磷酸化的升高，激活凋亡相关蛋白PARP1的剪切体的表达，可显著增加癌细胞对顺铂等化疗药物的敏感性[8]。磷酸化γH2AX蛋白是DNA双链损伤的效应器，其变化可反映DNA双链损伤的程度[9]。本研究显示，4μmol•L-1顺铂联合20μmol•L-1的姜黄素可以引起磷酸化γH2AX表达明显上升，PARP1蛋白剪切体表达增加；联合用药诱导HGC27细胞的凋亡也相应增加。本研究结果为如何降低顺铂毒副作用、提高顺铂化疗药物的敏感性提供了新的思路。

顺铂联合姜黄素作用于HGC27细胞，可以增强顺铂诱导细胞凋亡的作用。姜黄素增强顺铂杀伤HGC27细胞作用的原因可能是姜黄素增强了顺铂和DNA的结合能力，从而抑制DNA修复功能[10]，使肿瘤细胞DNA损伤加重，促进细胞的凋亡。本文对顺铂联合姜黄素促进胃癌细胞凋亡作用进行了初步研究。姜黄素是否能增加其它化疗药物效果或用于逆转顺铂耐药细胞的敏感性和减少化疗药物毒副作用等值得深入研究。

参考文献

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作者：李爱萍 王强 陈敏娟 周建伟 单位：南京医科大学公共卫生学院