涎腺腺样囊性癌细胞来源微泡研究范文

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［摘要］

目的：通过检测涎腺腺样囊性癌来源微泡量与神经生长因子表达量的关系，为进一步探求涎腺腺样囊性癌复发、转移、扩散及嗜神经侵袭的机制提供分子生物学的实验依据。方法：用扫描电镜观察微泡分泌量的情况。采用超高速密度梯度离心法分离纯化微泡，以WesternBlotting技术检测其标志性蛋白的表达。结果：神经生长因子的表达和ACC－2微泡的分泌呈正相关性。从ACC－2培养上清中分离出的小泡，透射电镜下观察为直径50－100nm、大小均一、具有明显异质性的圆形或椭圆形膜性小囊泡，有完整的包膜，内为低电子密度物质；WesternBlot检测出小泡中含有HSP70和MHC－Ⅰ的表达。结论：涎腺腺样囊性癌来源微泡可能在其嗜神经侵袭中起着重要作用，且与神经生长因子的表达密切相关。

［关键词］

微泡；腺样囊性癌；透射电镜；扫描电镜

微泡在免疫学领域、尤其肿瘤免疫治疗方面逐渐成为研究热点[1]。微泡是直径30～100nm的双层脂质膜包被的扁圆球形小泡，体内多种细胞都能分泌，其生物膜上和内容物中含有大量与其来源和功能密切相关的蛋白、核酸、脂质成分[2]。微泡可从多种体液中分离提取[3]，参与各种生理和病理过程[4]。目前有多种正常细胞和肿瘤细胞来源微泡的报道[5～8]。但对涎腺腺样囊 性癌细胞来源的微泡尚未见报道。涎腺腺样囊性癌（salivaryadenoidcysticcarcino－ma，SACC）是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，在涎腺恶性肿瘤中居第2位[9]。其局部侵袭性强，易沿神经鞘膜及组织间隙扩散，边界不清；易侵入血管，发生血运转移，转移率31．66％，是口腔领面部恶性肿瘤中远处转移率最高的肿瘤之一[10]。近年来有学者发现NTs及其受体在腺样囊性癌、前列腺癌、胰腺癌等具有嗜神经侵袭特性肿瘤中呈现特异性高表达，证实神经营养素家族及其受体与肿瘤嗜神经侵袭关系密切[11]。还有报道神经生长因子（nervegrowthfactor，NGF）及其受体是腺样囊性癌嗜神经侵袭机制的分子生物学基础之一[12]。此外，研究表明，表达特异性表面受体分子的细胞能分泌更多微泡[6]。由此推测，在培养体系中添加某些相关刺激因子可能会增加肿瘤细胞的微泡分泌。而微泡可能为探索涎腺腺样囊性癌的发病机理及临床诊断、治疗提供新的思路。故本研究通过探测不同表达量的生长因子及微泡分泌量的关系，为进一步探求涎腺腺样囊性癌复发、转移、扩散及嗜神经侵袭的机制提供分子生物学的实验依据。

一、材料和方法

1材料DMEM培养基（ThermoScientificHyclone，美国）；胎牛血清（上海复蒙基因生物科技有限公司）；NGF－7S（神经生长因子）、K252a（TrkA阻断剂）、重水、分析纯蔗糖（Sigma－Aldrich，美国）；鼠抗人MHC－I单克隆抗体、鼠抗人HSP－70单克隆抗体（Santa，美国）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG结合物（武汉博士德生物技术有限公司）；超高速冷冻离心机（Beckman，美国）、扫描电子显微镜S3400＋EDX（Hitachi，日本）；100kDaAmi－con超滤离心管（Millipore，美国）；透射电子显微镜（Hitachi，日本）；凝胶成像分析系统（UVP，美国）；细胞株：人涎腺腺样囊性癌细胞系ACC－2及ACC－M，人舌癌细胞系Tca8113，人皮肤恶性黑色素瘤细胞系A375（上述细胞株均由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室保存）。2细胞培养复苏细胞ACC－2、ACC－M、Tca8113、A375，弃去上清液，加入lmL培养基重悬，接种至75mm2培养瓶中，加入8mL培养基，放入37℃的CO2培养箱静置培养，按常规隔日换液，3d传代1次。待传代3次开始后续试验，收集更换的上清液，以备提取微泡用。3扫描电镜样品制备：4种细胞培养至对数生长期后，分别用0．25％胰酶消化收集，并作细胞计数，调整细胞密度1×105个／mL，接种50μL细胞悬液到6孔培养板中央（内置盖玻片），放入培养箱内孵育2h。孵育毕，倒置相差显微镜下观察到细胞开始贴壁，遂加入2mL培养基继续培养箱静置培养。次日，按如下分组更换培养液，37℃培养箱静置培养。（根据产品说明书确定最终工作浓度，NGF－7S：10ng／mL，K252a：100nM。）对照组仍加入DMEM培养液NGF组更换的DMEM培养液中加入NGF－7S使其最终浓度为10ng／mL阻断组吸除原培养液后，PBS5mL洗2次，加入工作浓度为100nM的K252a1mL，37℃孵育45min，吸除，PBS5mL洗2次，换为DMEM培养液于24h后吸除培养液，PBS液轻洗2次，取出细胞爬片，2．5％戊二醛（0．lmol／LPBSpH＝7．4配制）4℃固定24h。送电镜中心处理。脱水（用30％～100％浓度梯度乙醇逐级脱水）、临界点干燥、真空喷金。扫描电镜下观察、照相。4微泡提取：按照GMP（GoodManufacturingPractice）标准[16]提取制备微泡样品（ACC－2MV），用0．22μm滤器过滤除菌，分装，置于－80℃冰箱保存备用。5鉴定微泡5．1用透射电镜观察提取的ACC－2MV。采用负染法处理电镜样品，取20μLACC－2MV样品于载样铜网上，于室温静置1min；用滤纸从侧面吸干液体，滴加20g／L磷钨酸（pH＝6．8）约30μL于铜网上，室温负染1min；用滤纸吸干负染液，在白炽灯下烤干，于透射电镜下观察、照相。5．2用WesternBlotting法检测微泡标志性蛋白HSP－70和MHC－I在ACC－2MV中的表达。将微泡样品ACC－2MV和ACC－2细胞裂解物用SDS－PAGE凝胶分离，然后将蛋白转移到PVDF膜上，室温封闭后分别用鼠抗人HSP70、MHC－I单抗作为一抗，HRP标记的羊抗鼠抗体为二抗，用ECL化学发光法检测。6数据分析所有数据均为3次WesternBlot独立实验结果，以x±s表示。采用SPSS13．0统计软件进行统计学分析。采用ANOVA和t检验，取P＜0．05有统计学差异。

二、结果

1扫描电镜结果扫描电镜下，细胞表面附着多少不等的圆形、大小较均一的小泡。在对照组，4种细胞的微泡分泌均只在个别、少数细胞中观察到，且细胞表面附着的微泡数目较少；在NGF组，观察到A375、ACC－2、ACC－M细胞中有微泡分泌细胞数明显增多，且每个细胞微泡附着量也增多，但Tca8113细胞中有分泌细胞数增加不明显；在阻断组，4种细胞微泡分泌均显著减少，镜下几乎看不到有微泡附着的细胞（图1）。2微泡的鉴定2．1形态学观察：将ACC－2培养上清中分离出的沉淀，置于透射电镜下观察，可见大小均一、具有明显异质性的圆形或椭圆形膜性小囊泡，染色后可见囊泡中央色淡、周边浓染，边缘清晰。直径50～100nm，有完整的包膜，内为低电子密度物质（图2）。2．2WesternBlotting法检测微泡标志性蛋白HSP－70和MHC－I的表达（以beta－actin蛋白为内参）经免疫印迹分析，本实验从ACC－2培养上清中提取的微泡ACC－2MV中明显检测到了微泡标志性蛋白HSP－70和MHC－I的表达（图3）。UVP分析仪测得各蛋白条带的灰度值（表1），以目的蛋白的灰度值除以内参蛋白的灰度值校正误差，所得结果代表样品的目的蛋白相对含量。结果显示，和等量的ACC－2细胞裂解物相比，ACC－2微泡ACC－2MV内的HSP－70和MHC－I蛋白含量偏少，有统计学差异（P＜0．05）（表2）。

三、讨论

研究发现腺样囊性癌细胞表达NGF、NT－3及相应受体TrkA、TrkC与嗜神经侵袭相关，而且对ACC嗜神经侵袭起促进作用，而在其它无嗜神经性的恶性肿瘤及多形性腺瘤中均无表达。有研究报道，ACC病理切片中神经束的密度明显高于正常腮腺组织及腺泡细胞癌，认为ACC分泌神经生长因子刺激神经纤维向ACC肿瘤细胞群内生长。故神经生长因子及相应受体，可作为ACC的生物学标志物。研究发现神经生长因子NT－3可通过TkrC加强雪旺细胞迁移能力，而这一作用可被特异性酪氨酸激酶受体阻断剂K252a所阻断。在本实验中，研究对象恶性黑色素瘤（A375）、腺样囊性癌（ACC－2、ACC－M）均是有嗜神经侵袭特性的肿瘤，而舌癌（Tca8113）不具备这一特性。扫描电镜观察发现，体外培养恶性黑色素瘤细胞、腺样囊性癌细胞、舌癌细胞均可见微泡分泌，其中腺样囊性癌细胞、舌癌细胞只有个别细胞分泌微泡，但恶性黑色素瘤细胞有较多细胞分泌且每个细胞附着的微泡数也较多。实验结果还发现，恶性黑色素瘤和ACC细胞的微泡分泌量受神经生长因子（NGF）的影响，能显著增加；且神经生长因子受体阻断剂（K252a）能有效抑制微泡的分泌，间接说明微泡分泌的增加是受NGF影响。而舌癌细胞的微泡分泌不太受神经生长因子影响，也间接说明神经生长因子对嗜神经性肿瘤的作用。由此可假设，腺样囊性癌周围的神经组织能分泌神经生长因子及其他相关因子，作用于肿瘤细胞后，其微泡能大量分泌，进而由微泡携带肿瘤细胞的相关信息物质与神经组织互相作用。

目前已知微泡可由多种类型细胞分泌，包括血细胞、上皮细胞、神经细胞、肿瘤细胞等。在透射电镜下可观察到微泡的特征性形态－－碟状外形，即由脂质双分子层包被的扁圆球形。直径约30～100nm，密度在1．13～1．19g／mL之间。传统的微泡提取方法多是超高速差速离心和超滤离心法。而我实验组前期实验证明通过蔗糖密度梯度离心法提取微泡的量及纯度均较佳。目前对微泡的鉴定主要依赖形态学观察和蛋白组成分析。用透射电镜观察微泡形态，用WB鉴定特异性蛋白的表达。本实验观察到直径50～100nm，大小均一、具有明显异质性的圆形或椭圆形膜性小囊泡，在形态学上与已有报道的微泡特征相符，而与以往研究所呈现出来的差异，考虑是由于实验中电镜样本制备方法之间的差异引起的。此外，本实验检测的2种微泡标志性蛋白（MHC－I及HSP－70）均有良好表达，且微泡内的这两种蛋白含量较细胞内少，其差异性有统计学意义。由此可见，本实验通过差速离心法及重水蔗糖垫法成功分离提取到了涎腺腺样囊性癌细胞分泌的微泡。综上所述，对涎腺腺样囊性癌来源微泡进行的初步研究，将为涎腺腺样囊性癌发病机制的研究以及涎腺腺样囊性癌的临床治疗提供一个新的契机。

作者：张卓远 严超然 李博 李龙江 单位：四川大学华西口腔医院头颈肿瘤外科·口腔疾病研究国家重点实验室