抑制剂对胃癌细胞增殖的影响范文

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【摘要】

目的探讨Notch2和MEK／ERK信号通路在胃癌细胞SGC－7901中是否存在交叉作用。方法采用体外化学合成的特异性针对Notch2的siRNA（Notch2siRNA）和丝裂原激活蛋白激酶（MEK）／细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路的抑制剂PD98059，分别单独和联合处理体外培养的胃癌SGC－7901细胞，以转染阴性对照siRNA（controlsiRNA）细胞作为siRNA对照组，并设不给予任何转染的空白对照组。免疫印迹（WesternBlotting）法检测磷酸化ERK1／2（p－ERK）1／2和Notch2蛋白的表达水平。比色法（MTT）检测癌细胞增殖抑制率。结果Notch2siRNA能降低蛋白Notch2的表达水平，并抑制癌细胞增殖［（38．26±1．82）％］，而p－ERK的表达水平则较对照组增加。PD98059能降低p－ERK的表达水平，并抑制癌细胞的增殖［（30．05±3．16）％］，Notch2水平则无明显变化，联合应用Notch2siRNA和PD98059能明显降低p－ERK和Notch2蛋白的表达水平，与Notch2siRNA或PD98059单独应用比较，显著抑制癌细胞增殖率，差异有统计学意义［（72．55±5．30）％，P＜0．01］。结论特异性抑制Notch2信号通路，且抑制MEK／ERK通路可进一步增强抑制Notch2通路的抗肿瘤增殖效果，提示MEK／ERK和Notch22条信号通路在胃癌SGC－7901细胞中存在交叉作用。

【关键词】

Notch2；MEK／ERK；抑制剂；信号通路；交叉作用

胃癌在我国乃至世界范围内均为常见的恶性肿瘤之一，其发病率与病死率在我国有上升趋势［1］。目前，我国胃癌的整体诊治水平仍不高，针对肿瘤细胞生长、凋亡等分子生物靶点提出的分子靶向治疗逐渐成为胃癌综合治疗的重点和热点［2］。有研究表明，Notch信号通路的活性紊乱与多种肿瘤（如胃癌）的形成有关，阻滞Notch信号通路将有望成为肿瘤治疗的新策略［3－4］。Notch基因通过编码跨膜受体而诱发多级生物级联反应，从而参与如细胞增殖、凋亡、周期转变、分化、血管生成、细胞侵袭、细胞迁移、上皮细胞－间充质转化（EMT）等细胞生物学过程［3－5］。丝裂原激活蛋白激酶（MEK）／细胞外信号调节激酶（ERK）在多种癌细胞中呈高表达，ERK的活化位于MEK超家族信号转导过程中的下游，主要负责由MEK始动的生物信息转导，处于这一通路的中心环节［6］。有研究发现Notch和ERK通路存在相互作用，共同参与细胞分子生物学行为［7］。本实验通过单独或联合阻滞这2个信号通路，探讨其在胃癌细胞系SGC－7901中的作用及影响。报道如下。

1材料与方法

1．1一般材料（1）细胞：胃癌SGC－7901细胞系由台州学院肿瘤研究所细胞培养实验室传代保存。（2）试剂：RPMI－1640培养基购自美国GIBCO生物技术公司；ERK1／2抗体、磷酸化ERK1／2抗体、Notch2抗体、GAPDH抗体及相关二抗试剂盒均购自美国的CST公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）、PD98059和二甲基亚砜（DMSO）购自美国的Sigma公司；Notch2siR－NA及阴性对照siRNA（ControlsiRNA）购自美国的SantaCruz公司；提取总蛋白试剂盒及WesternBlotting所需的其他试剂来源于碧云天生物技术有限公司。

1．2方法

1．2．1细胞培养和siRNA转染胃癌SGC－7901细胞置入含10％小牛血清的RPMI－1640培养液中。6％CO2浓度、37℃培养。1×107／L细胞接种于细胞培养板（MTT使用96孔板，其他实验采用6孔板）。根据说明书建议，将siRNA浓度稀释为50nmol／L，应用脂质体转染法转染siRNA。siRNA转染实验分为3组，Notch2siRNA干预组、阴性对照siRNA组、空白对照组。

1．2．2比色法（MTT）检测细胞增殖采用含10％胎小牛血清的培养液将贴壁细胞配成单个细胞悬液，浓度为10000～20000／mL，每孔体积200μL细胞接种到96孔板，细胞贴壁后即加处理因素，每种处理设5个复孔。使用酶联免疫检测仪测定490nm处的吸光度（A值），按照公式计算细胞增殖抑制率（CI）／％＝1－（处理组平均A值／空白组平均A值）×100％，并绘制直方图，实验重复3次。1．2．3免疫印迹法（WesternBlotting）检测收集各组细胞，提取总蛋白，将样品置于100g／L不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶加样孔中，初始电压为80V，当溴酚蓝前沿进入分离胶后，电压提高至120V，继续电泳直至分离胶底部。电转移至硝酸纤维素膜，封闭，与Notch2抗体、ERK1／2抗体或磷酸化的ERK1／2抗体4℃孵育，过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温摇晃1h，显色，放射自显影。显影信号的强弱用密度分析值反映ERK1／2、磷酸化的ERK1／2、Notch2水平（以GAPDH蛋白为内参对照）。

1．3统计学处理采用SPSS18．0统计软件进行数据分析，计量资料组间比较使用配对t检验，多组间比较应用方差分析，计数资料采用等级相关检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1胃癌SGC－7901细胞的Notch2阻滞导致ERK1／2活化使用脂质体转染法将Notch2siRNA载体瞬间转染人胃癌SGC－7901细胞，转染48h后WesternBlot验证Notch2siRNA干扰SGC－7901细胞中活化的Notch2蛋白（ICN2）表达，活化的Notch2表达显著下调，即出现Notch2通路阻滞，并伴随磷酸化的ERK1／2表达增加，致使ERK1／2活化，提示ERK1／2活化与Notch2下调有关。见图1。

2．2联合应用Notch2siRNA和PD98059对Notch2和p－ERK1／2的表达水平的影响Notch2siRNA转染能显著降低蛋白Notch2的表达水平，而p－ERK1／2的表达水平则较对照组增加；MEK／ERK通路的抑制剂PD98059能降低p－ERK1／2的表达水平，Notch2水平则无明显变化；Notch2siRNA和PD98059联合应用后，p－ERK1／2和Notch2蛋白的表达水平均降低。见图2。

2．3Notch2siRNA和PD98059联合应用对SGC－7901细胞增殖的影响Notch2siRNA和PD98059均能抑制胃癌SGC－7901细胞增殖，其细胞增殖抑制率分别为（38．26±1．82）％和（30．05±3．16）％，且Notch2siRNA和PD98059联合应用癌细胞的增殖率降低更明显，其细胞增殖抑制率为（72．55±5．30）％，显著高于Notch2siRNA和PD98059单独处理，差异有统计学意义（P＜0．01）。见图3。

3讨论

Notch通路家族包括4个受体（Notch－1、2、3、4）和5种配体（jagged－1，jagged－2，Delta样受体1、3、4）［3－5，8］。细胞Notch受体与邻近细胞Notch配体结合后，Notch通路即被激活［8］。激活的Notch蛋白在金属蛋白酶肿瘤坏死因子－α转化酶（TA－CE）和γ－分泌酶复合物（γ－secretasecomplex）的蛋白水解下，释放其细胞内部分ICN，当ICN进入细胞核后活化Notch－CSL复合物，则进一步调控多个下游靶基因的表达［9］。如果采用特异性针对Notch2的siRNA下调Notch2表达则能阻断上述过程。

MEK／ERK通路在多种癌细胞中呈高表达，ERK的活化位于MEK超家族信号转导过程中的下游，主要负责由MEK始动的生物信息转导，处于这一通路的中心环节。使用特异性抑制剂降低其下游磷酸化ERK的水平，从而阻断ERK的磷酸化活化及其下游信号级联反应，从而阻断MEK通路的生物学效应［10］。本组的前期工作发现，非选择性Notch通路阻滞剂DAPT（一种γ分泌酶抑制剂）未能诱导胃癌细胞明显凋亡，却激活ERK1／2通路［11］。当然，DAPT对Notch通路家族（Notch1～4）均可能有阻滞作用，具体是哪个Notch通路家族成员的阻滞而导致ERK1／2活化，以及ERK1／2活化对该Notch通路阻滞的抗肿瘤作用的影响及机制尚不清楚。由于维持癌细胞生存的信号转导过程是由一个复杂的网络系统完成，对癌细胞某单一生存信号通路的阻滞常导致其他的生存信号通路的激活，从而使癌细胞有可能逃脱针对单一通路的治疗作用［12］。

本研究结果表明，Notch2siRNA能抑制癌细胞的增殖，降低蛋白Notch2的表达水平，而Notch2siRNA也能增加p－ERK1／2的表达水平。PD98059能降低p－ERK1／2的表达水平，并抑制癌细胞的增殖，但对Notch2表达水平则无明显变化。与单独使用Notch2siRNA或PD98059比较，联合使用Notch2siRNA和PD98059阻滞这2种信号通路后，能更显著地降低p－ERK1／2和Notch2蛋白的表达水及胃癌细胞的增殖率。提示Notch2信号通路被抑制后ERK1／2通路活性被某种程度地上调，在此基础上应用MEK／ERK通路抑制剂PD98059，从而抑制ERK1／2通路，使得2条通路均被抑制，则胃癌细胞的增殖抑制率更明显。由此本组设想，Notch2通路的阻滞可能会导致胃癌细胞中其他生存信号通路（如ERK1／2通路）的活化，从而使胃癌细胞有可能逃脱针对Notch2通路的靶向治疗作用。然而，该作用在不同分化程度的胃癌细胞中是否具有普遍性，以及Notch2阻滞诱导的ERK1／2活化对胃癌细胞恶性生物学行为的具体作用及其机制，则有待于通过本项目的深入研究。

作者：刘富强 陈依依 岳婷婷 叶蓓 钱翠娟 姚军 单位：台州学院椒江校区医学院医学检验教研室 浙江省台州市立医院消化内科