子宫内膜癌细胞论文范文

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1材料和方法

1．1材料来源

1．1．1Westernblot法检测用蛋白裂解缓冲液提取蛋白，取上清用ELISA试剂盒(德国，Pierce)检测总蛋白浓度。取70μg的总蛋白于10%SDSPAGE电泳，电转移至PVDF膜，5%的脱脂奶封闭，分别加兔抗人Matriptase(1∶1000)、兔抗人HAI-1(1∶10000)，使用鼠源性β-actin单克隆抗体(1∶1000)作为内参照，4℃孵育过夜，HRP标记的二抗孵育，ECL化学发光剂显色，于暗室中显影定影。X片用Tan-non图像分析系统照相，采用TanonGis软件4．0自动分析软件进行积分光密度分析，以Matripase(HAI-1)/β-actin积分光密度比值表示相对蛋白含量。

1．1．2RNA干扰构建3条由慢病毒载体表达的Matriptase基因siRNA(Ma-siRNA-89851、-siRNA-89881和-siRNA-89873)，其中Ma-siRNA-89873对Matriptase抑制水平最显著。实验前1天，HEC-1A和RL952细胞接种在6孔板，密度约(3～5)×104/ml，配制1×108TU/ml病毒。根据预染结果，每孔加病毒量20μl，总体积1ml，转染72h后，荧光显微镜下观察细胞内GFP表达情况，同时以正常培养基为空白对照组(Control，Con)慢病毒载体NO53为阴性对照组(Negativecontrol，NC)。荧光定量PCR和Westernblot法检测siRNA干扰后Matriptase表达情况。

1．1．3细胞划痕实验用ImageJ软件测量各个时间点的划痕两侧的细胞间距离(μm)变化，以0h划痕边沿的距离减去24h迁移边沿的距离来计算细胞的迁移距离，反映细胞的迁移能［4］。

1．1.4穿膜小室实验Transwell小室直径上取5个视野，照相，计数每个视野穿过膜的细胞数，取其平均值，结果以x珋±s表示。以穿膜细胞数反映肿瘤细胞的侵袭能力［5］。

1．2统计学处理采用SPSS19．0统计软件。上述实验均重复3次，实验数据以x珋±s表示，计量资料进行单因素方差分析，双变量相关分析采用Person分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1荧光定量PCR和Westernblot检测Matriptase、HAI－1mRNA及蛋白表达情况HEC-1A、HEC-1B、RL952细胞中，MatriptasemRNA相对表达量分别为(0．2123±0．021)、(0．000695±0．00012)和(0．1778±0．013)，组间比较差异有统计学意义(F=122．629，P＜0．001);HAI-1mRNA相对表达量分别为(0．2827±0．049)、(0．00263±0．00043)和(0．2420±0．032)，组间比较差异有统计学意义(F=32．875，P＜0．01)。Matriptase和HAI-1蛋白在HEC-1A和RL952中均呈阳性表达，但两者在HEC-1B中均未表达或低于可测水准，与mRNA水平相吻合。HEC-1A、RL952和HEC-1B细胞中Matriptase/HAI-1mRNA比值分别为0．75、0．73和0．02;HEC-1A和RL952细胞比较差异无统计学意义(P＞0．05)(图1)。

2．2转染siRNA后HEC-1A和RL952细胞中Matriptase、HAI-1mRNA和蛋白表达HEC-1A和RL952细胞中，空白组(Con)和阴性对照(NC)组中Matriptase和HAI-1的表达水平比较，差异均无统计学意义(P＞0．05)。与阴性对照组(NC)比较，转染siRNA-89873后两株细胞的MatriptasemRNA表达水平均显著下调(HEC-1A:0．2157±0．0124vs0．0358±0．0111，P＜0．001;RL952:0．1849±0．0053vs0．0341±0．0017，P＜0．001)，抑制率分别达到83．4%和81．5%;但两株细胞的HAI-1mRNA表达水平无显著差异(P＞0．05)。Matriptase和HAI-1蛋白水平改变情况与mRNA水平相一致(图2、3)。转染Matriptase的靶向siRNA后，子宫内膜癌HEC-1A细胞的Matriptase/HAI-1的比值降为0．11，而RL-952细胞则降为0．12。

2．3RNA干扰后HEC-1A和RL952侵袭迁移能力的改变小分子RNA干扰Matriptase表达后两株细胞的迁移能力和侵袭能力变弱。Person相关性分析显示，MatriptasemRNA表达水平与肿瘤细胞迁移距离和穿膜细胞数均呈正相关(R迁移=0．97，R侵袭=0．982;P均＜0．01)。

3讨论

肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的病理过程，包括降解ECM从而促进肿瘤细胞的分离、种植和远处扩散。目前认为，基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶在该过程中扮演了重要的角色。Matriptase是TTSPs家族成员之一，与肿瘤的增殖、进展和转移密切相关。据统计，全球女性肿瘤发病率中，子宫内膜癌占第四位，仅次于乳腺癌、肺癌和大肠癌，居全球女性生殖道肿瘤的第一位。迄今为止，子宫内膜癌中Matriptase/HAI-1相关性的研究仅有2篇，Matriptase/HAI-1在子宫内膜癌发生发展中所扮演的角色尚未可知。Nakamura等首次提出，Matriptase可能与子宫内膜癌的预后不良相关，Matriptase高表达与侵及子宫肌层深度(P=0．004)、宫颈浸润(P=0．021)、淋巴结转移(P=0．009)及腹水细胞学(P=0．045)等侵袭转移生物学行为密切相关。HAI-1作为ECM降解系统的另一重要角色，在子宫内膜癌标本中表达水平明显低于正常内膜标本;增加HAI-1基因的表达水平可有效抑制内膜癌细胞的增殖和侵袭迁移能力，且伴随着Matriptase表达水平的下调。由此有学者提出，维持Matriptase/HAI-1的平衡状态在肿瘤的进展过程中至关重要。据报道，Matriptase/HAI-1比值的失衡包括上升或下降都可能具有促进肿瘤的发生发展。在胰腺癌细胞中发现HAI-1表达水平下降，伴随Matriptase表达水平升高，HAI-1表达的缺失和Matfiptase/HAI-1比值降低促进肿瘤细胞的侵袭生物学特征。同样在前列腺癌中亦发现，Matfiptase/HAI-1比值随着前列腺癌恶性程度的递增而升高。而Matriptase/HAI-1比值在进展期结直肠癌中表现为下降，在浸润性乳腺癌中比值下降而在侵袭性乳腺癌中比值明显上升。本研究在Matriptase和HAI-1阳性表达的子宫内膜腺癌RL952细胞和HEC-1A细胞中Matriptase和HAI-1表达水平及Matriptase/HAI-1比值，差异无统计学意义(P＜0．05)，侵袭迁移能力亦无差异;而HEC-1B细胞呈Matriptase和HAI-1极低水平，mRNA和蛋白均显示为阴性表达。在Matriptase-HAI-1系统阳性的HEC-1A和RL952细胞中，采用siRNA特异性下调Matriptase表达，HAI-1基因表达未见变化，但Matriptase/HAI-1比值由敲除前约0．77降低到敲除后0．11，而细胞的侵袭迁移能力显著下降。统计学分析显示，Matriptase表达水平、Matriptase/HAI-1比值与子宫内膜癌细胞侵袭迁移能力呈正相关。HEC-1B细胞为高侵袭能力细胞株，而其Matriptase和HAI-1系统呈阴性表达，猜想与细胞的遗传背景不同相关(如雌激素受体表达水平)，且肿瘤的侵袭和转移过程复杂，所涉及信号通路繁多，如抗凝血酶、蛋白酶活化受体2(protein-aseactivatedreceptor-2，PAR-2)、前列腺蛋白酶原、miRNA等。此外亦有文献报道，Matriptase表达水平和Matriptase/HAI-1比值在进展至侵袭阶段时呈降低趋势，后期可通过增加Matriptase表达水平进一步探究Matriptase在子宫内膜癌侵袭迁移过程中扮演的角色。

综上，Matriptase表达与子宫内膜癌细胞侵袭迁移能力呈正相关。但为了但全面完善评估Matriptase在子宫内膜癌侵袭转移过程中的角色，动物体内荷瘤实验必不可少。总之，Matriptase与子宫内膜癌的侵袭转移过程密切相关，可能成为判断肿瘤预后的新指标及辅助治疗的新靶标。

作者：薛丽芳孙蓬明项双卫毛晓丹阮冠宇董滨华林芬单位：福建医科大学教学医院福建省妇幼保健院妇科肿瘤实验室福建医科大学附属协和医院妇产科