橙皮素抑制癌细胞论文范文

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1材料与方法

1．1实验分组根据MTT检测结果，后续研究采用50和100μmol•L－1处理组进行实验。按照橙皮素作用浓度不同将细胞分为3组：DMSO对照组、50和100μmol•L－1橙皮素处理组；DMSO对照组中用DMSO代替橙皮素，其体积分数不超过0．2mL•L－1。各组细胞置于37℃、5％CO2环境中培养至一定时间后，进行相关指标检测。

1．2流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期每组收集1×106个细胞，用冰浴预冷的PBS洗3次，再用冰浴预冷的70％乙醇固定，4℃过夜。2000r•min－1离心3～5min，沉淀细胞。每管细胞样品中加入0．5mL碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min，经流式细胞仪检测，平行实验重复3次。实验结果以细胞凋亡百分率和细胞周期各时相百分率表示。

1．3荧光定量PCR检测采用Trizol法提取各组细胞总RNA，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，以A260／A280＝1．8～2．0为宜。以经反转录获得的cDNA作为模板，采用SYBRGreen荧光染料，按照试剂盒说明进行定量PCR。定量PCR反应条件为：变性，95℃、30s；PCR反应，95℃、5s，60℃、20s，共40个循环；95℃、5s，60℃、1min。然后按照每15s上升0．3℃至95℃后，保持15s。分别收集荧光信号，进行熔解曲线分析。经定量PCR后，分别获得各组细胞中GAPDH的Ct值和目的基因的Ct值，Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，采用相对定量PCR2－ΔΔCt值法计算各目的基因相对于GAPDH基因的表达量。ΔΔCt＝（实验组目的基因Ct－实验组管家基因Ct）－（对照组目的基因Ct－对照组管家基因Ct）。平行实验重复3次。

1．4免疫印迹分析收集各组细胞，用蛋白裂解液裂解细胞以获取各组细胞总蛋白，并用蛋白浓度测定试剂盒测定各组总蛋白浓度，以保证上样时各组蛋白水平一致。蛋白变性后经SDS－PAGE分离，再转移至PVDF膜上，用脱脂奶粉封闭，加兔抗人Notch1（1∶1000）和Hes－1（1∶1000）以及GAPDH（1∶1000），4℃过夜。加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温摇动1h。用ECL显色，X线曝光显影。平行实验重复3次。采用Image软件分析免疫印迹结果中各条带的灰度，将各组GAPDH条带灰度值标准化，并以DMSO对照组为1进行标准化，分析各目的蛋白的表达变化。1．8统计学分析应用SPSS10．0统计软件对数据进行分析处理。各组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、细胞周期百分率和基因相对表达水平均以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。

2结果

2．1各组Tca8113细胞增殖抑制率与DMSO对照组比较，125μmol•L－1橙皮素处理组24、48和72hTca8113细胞增殖抑制率明显升高（7．88％±1．90％、26．28％±2．20％和47．05％±1．90％）（P＜0．05）；在橙皮素处理72h后，25、50、75、100和125μmol•L－1橙皮素处理组细胞增殖抑制率分别为（6．14±1．20）％、（28．69±2．10）％、（28．33±2．60）％、（45．26±3．00）％和（47．05±1．90）％，橙皮素对Tca8113细胞的增殖抑制作用呈现时间剂量依赖性。且在同一监测点（24、48和72h），50和75μmol•L－1橙皮素处理组细胞增殖抑制率［（4．89±1．40）％vs（5．77±1．80）％、（17．91±2．60）％vs（19．27±2．30）％、（28．69±2．10）％vs（28．33±2．60）％］组间比较差异无统计学意义（P＞0．05），100和125μmol•L－1橙皮素处理组细胞增殖抑制率［（6．96±2．00）％vs（7．88±1．90）％、（24．21±2．70）％vs（26．28±2．20）％、（45．26±3．00）％vs（47．05±1．90）％］比较差异亦无统计学意义（P＞0．05），故选择50和100μmol•L－12个浓度进行后续实验。

2．2各组细胞凋亡率和细胞周期百分率48和72h细胞凋亡检测结果显示：50和100μmol•L－1橙皮素处理组的细胞凋亡百分率分别为（15．9±1．8）％、（23．4±1．7％）和（27．4±1．6）％、（35．1±1．9）％，均高于同监测点DMSO对照组（1．4％±0．3％，2．9％±0．5％），差异有统计学意义（P＜0．05）；且100μmol•L－1橙皮素处理组细胞凋亡百分率高于同监测点50μmol•L－1橙皮素处理组（P＜0．05）。见图1。细胞周期结果显示：橙皮素作用于Tca8113细胞后，G0／G1期细胞百分率明显升高，S期细胞百分率明显下降（P＜0．05）。见表1。

2．3橙皮素作用下Notch1和Hes－1mRNA表达水平荧光定量PCR结果显示：与DMSO对照组比较，100μmol•L－1橙皮素处理组细胞中Notch1（2．06±0．11）和Hes－1（2．61±0．11）的mRNA相对表达水平均升高（P＜0．05）。见表2。2．4橙皮素作用下Notch1和Hes－1蛋白表达免疫印迹检测结果显示：与DMSO对照组比较，100μmol•L－1橙皮素处理组细胞中Notch1蛋白及其活化形式Hes－1蛋白表达均上调。见图2。

3讨论

橙皮素是一种广泛存在于芸香科柑橘属植物中的黄烷酮类化合物［6］，除具有抗肿瘤和免疫调节作用外，还因其易于从食物中获取，且直接作用于口腔等优点在舌癌治疗中显现出较大优势，而对其抑癌作用机制的探讨将有助于舌癌防治的研究。本研究结果显示：橙皮素能够抑制舌癌细胞的增殖，并且抑制作用呈现时间－剂量依赖性。不同浓度橙皮素作用后，Tca8113细胞发生明显凋亡以及细胞周期G0／G1期阻滞。这些结果说明橙皮素是通过诱导细胞凋亡和阻碍细胞周期进程发挥对舌癌细胞生长的抑制作用。这一结果与Alshatwi等［7］在研究橙皮素对宫颈癌细胞作用时的结果一致。Notch信号通路是一条对多种组织和器官发育起重要调控作用的信号传导系统［8］。研究表明：作为哺乳动物Notch受体之一的Notch1在不同肿瘤甚至同一肿瘤的不同发展阶段具有不同的、甚至截然相反的作用，Notch1发挥“促癌”还是“抑癌”作用，与细胞所处环境有密切关联，干预Notch1活化对肿瘤发生发展及转归具有重要意义。本课题组以前研究［11］显示：Notch1信号通路的活化能够抑制舌癌细胞增殖和导致细胞周期发生G0／G1期阻滞。本文作者提出假设：橙皮素对Tca8113细胞产生的这些作用可能与Notch1信号激活有关联。为了验证这一假设，本文作者检测了橙皮素作用前后Tca8113细胞中Notch1基因及其活化形式Hes－1的表达情况，结果发现：橙皮素作用后，Notch1和Hes－1mRNA和蛋白的表达水平均升高，Notch1呈现激活状态。而Notch1的活化对细胞凋亡和细胞周期会产生重要影响。因为Notch1不仅可以通过激活JNK和p53诱导细胞凋亡［12－13］，而且活化的Notch1还能够通过改变细胞周期蛋白D1、Rb和p16等G1期调节剂而导致细胞周期出现G1期阻滞［14－15］。综上所述，橙皮素抑制舌癌细胞增殖的作用机制可能与激活Notch1信号传导、进而诱导细胞凋亡和细胞周期G0／G1期停滞有关联。

作者：刘治慧杨巍单位：台州学院附属市立医院口腔科北华大学医学检验学院免疫学教研室台州学院医学院检验系