结直肠癌细胞论文范文

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1材料与方法

1．1小鼠DC细胞分离培养［6－7］断颈处死小鼠，75％酒精中浸泡5min，超净台中无菌取出小鼠的股骨、胫骨，剪去两端，用1mL注射器吸buffer刺入骨髓腔，反复冲洗直至骨发白，200目滤网冲过滤，收集细胞悬液，离心（300g，10min），加入红细胞裂解液，离心去上清，buffer清洗沉淀后再次离心。用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，接种于24孔板（1×106／mL），加入细胞因子GM-CSF50ng／mL、IL-425ng／mL，37℃，5％CO2，进行培养。48h后，弃培养基，PBS清洗1遍，加入新的培养基。之后隔天半量换液。第8天加入LPS继续培养24h，离心收集的悬浮细胞即为DC细胞。

1．2CT26．WT细胞与全T细胞共培养37℃，5％CO2培养的CT26．WT细胞待密度超过80％，胰酶消化，计数待用。T细胞∶CT26．WT（10∶1）进行混合培养，48h后做实验研究。

1．3DC细胞与T细胞共培养腹腔注射第1、15天的DC细胞与对应的T细胞，调至适当浓度至1×106个／mL（DC∶T＝1∶10），加入96孔板，100μL／孔，混合培养48h。每组设5个复孔，同时设单独DC细胞孔、单独T细胞孔。刺激能力的计算：（混合孔－单独DC细胞孔）／单独T细胞孔。

1．4B7H4的检测取新鲜的人结直肠癌组织及配对的正常肠上皮组织8对；CT26．WT细胞腹腔注射第15天的BALB／c小鼠，待腹腔成瘤后，取肿瘤组织及配对的正常肠组织1对，IHC检测B7H4的表达；腹腔注射的第0、1、2周，取小鼠肠组织及肿瘤组织，WesternBlot检测组织蛋白B7H4的表达。

1．5统计学方法所有数据采用SPSS17．0统计软件进行单因素方差分析、t检验等。P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1DC细胞在镜下的细胞形态第8天可见多数细胞呈集落样生长。

2．2腹腔注射不同时间段的全T细胞对CT26．WT的杀伤效应腹腔注射不同时间段（1、3、5、7、9、11、15d）全T细胞与CT26．WT（10：1）混合共培养48h后，CCK8结果示第7天，活细胞数开始略上升，第15天最高（第1天：OD＝1．24400±0．25146；第15天：OD＝3．05767±0．86557；P＝0．000，差异有统计学意义，图2）；第1、15天的共培养体系进行细胞凋亡检测：第15天细胞凋亡率降低（第1天：CT26凋亡率8．667±0．4055；第15天：CT26凋亡率3．633±0．4910；P＝0．001，差异有统计学意义）。

2．3流式细胞术检测DC细胞表型腹腔注射的第1、15天，DC细胞表面分子MHC-Ⅱ阳性率（79．000±1．9348vs51．000±2．9180）比较，差异有统计学意义。

2．4DC细胞表面分子ICAM-1的表达搜集腹腔注射不同时间段（0d－正常小鼠，1、3、5、7、9、11、15d）的DC细胞，WesternBlot检测ICAM-1的表达。第9天其表达开始下降，第15天最低。

2．5IHC检测B7H4在正常肠上皮（N）和癌组织（T）中的表达WesternBlot检测腹腔注射不同时间段小鼠组织B7H4的表达9对组织（8对人来源的，1对鼠来源的）均显示B7H4在癌组织中表达增高（图5）。腹腔注射第0、1、2周，正常肠上皮组织（第0周）B7H4表达很微弱，第1、2周，腹腔内已有肿瘤形成，肿瘤组织B7H4表达上升。2．6腹腔注射1、15天，DC细胞刺激T细胞增殖能力的比较第1天：2．77±0．017214；第15天：2．33±0．016836；P＝0．000，差异有统计学意义。

3讨论

肿瘤免疫机制是一个复杂的网络系统，已有研究发现：B7H4可以抑制T细胞的激活和增殖；TGF-β可以诱导免疫抑制［12］；结直肠癌来源的成纤维细胞可以抑制自然杀伤细胞的功能等［13］。1970年，Bretscher和Cohn已证实“协同刺激信号”决定着T细胞免疫的方向，在宿主抵抗外来入侵时至关重要，而T细胞活化的第一信号就来源于APC所提呈的抗原。DC细胞是1973年由Steinman等［14］首先发现的，是目前所知抗原提呈能力最强的APC，而T细胞活化则需要两个信号：第1信号来自DC等细胞提呈的抗原，第2信号则为共刺激分子包括B7／CD28、ICAM-1／LFA-1、LFA-3／CD2等，缺乏任一信号T细胞都不能有效地发挥处理肿瘤细胞的能力。

本研究将CT26．WT腹腔注射入BALB／c小鼠体内，动态观察其对宿主产生的影响，利用该细胞株的高侵袭性，短时间内构建肿瘤与免疫的模型。利用T细胞与肿瘤细胞共培养，发现T细胞的杀伤能力下降，其后对这一结果做进一步研究，着重观察抗原递呈的改变。发现随着腹腔注射时间的延长，抗原提呈细胞DC细胞表面分子MHC-Ⅱ的表达降低；LFA-1／ICAM-1参与T细胞的活化、增殖、分化及归巢等多种生理过程，WesternBlot检测发现DC细胞表面分子ICAM-1表达也下降。最终使T细胞杀伤CT26．WT细胞的能力下降。另外，肿瘤细胞表面分子发生改变也是肿瘤逃逸的原因，本研究取新鲜的结直肠癌组织标本，以及腹腔注射第1、2周的小鼠结肠癌组织，免疫组化及WesternBlot检测均发现肿瘤高表达B7H4，这又进一步抑制了T细胞的活化。综合以上对BALB／c小鼠体内外实验的初步探究，提醒我们在关注肿瘤本身的同时，也应将眼光聚焦于与肿瘤生存密不可少的免疫环境。研究表明用肿瘤细胞mRNA致敏DC细胞可以产生特异性抗肿瘤反应，了解高表达B7H4的肿瘤细胞与DC细胞之间的微观分子机制，明确DC细胞与肿瘤的相关信号转导途径的关系，将对肿瘤的治疗与预防有着重要的意义。

作者：冯娜周娜邓永键单位：南方医科大学基础医学院病理学系