胰腺肿瘤癌细胞论文范文

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1材料与方法

1.1研究方法

1.1.1Westernblot法依照蛋白提取试剂盒说明书进行各细胞株总蛋白的提取，BCA定量试剂盒进行蛋白浓度的测定，样品定量为5g/L，于每条泳道进行上样50μg蛋白，采用12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺进行凝胶电泳，在电压70V条件下经80min电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2h，加入一抗，在4℃条件下孵育过夜。TBST洗膜后，加入二抗室温条件下孵育1.5h，TBST清洗，采用ECL发光，以凝胶显像仪进行显像。采用QuantityOne进行灰度值检测。

1.1.2qRT-PCR法按照RNA分离试剂盒及TRIzol试剂盒说明书步骤提取并纯化各细胞株总RNA，所有RNA样本浓度均稀释至1g/L，依据逆转录及扩增试剂盒说明书规定步骤进行逆转录及扩增。总RNA浓度测定：用DEPC水调零后取1.5μL样品置于ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计测样台上进行测量，对A260/A280值以及浓度进行记录，总RNA样品在A260/A280为1.8~2.0，RNA纯度较高，无DNA、蛋白质等污染，浓度为100~1458.2μg/μL。总RNA完整性检测：取RNA样品1μL，1%琼脂凝胶电泳80V电压电泳20min，EB染色10min，于凝胶成像系统下观察并进行拍照。结果显示5sRNA、18sRNA、28sRNA条带完整，总RNA抽取完整。RT-PCR反应体系为（2×All-in-OneqPCRMix10μL，45×SyberGreen2μL，PrimerF1μL，PrimerR1μL，cDNA2μL，ddH2O4μL），反应条件如下：95℃预变性10min；95℃变性10s、60℃退火20s、72℃延伸10s，45个循环。所有反应均设立复孔，并以DEPC水代替模板，cDNA作为阴性对照。

1.1.3siNDRG1及阴性对照序列转染PANC-1细胞siNDRG1及阴性对照序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。转染前24h取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化成单细胞悬液，分别以10×104和20×104/孔接种至24孔板中，对融合达到70%~90%的细胞株进行转染，细胞分3组：空白对照组、siNDRG1组及阴性对照组。对siNDRG1组及阴性对照序列组依照LipofectamineTM2000试剂说明书步骤进行转染，转染48h后按照miRNA提取及分离试剂盒说明书步骤进行总RNA完整性检测，应用紫外线分光光度仪检测RNA溶解光密度值A（介于260~280nm处比值），计算RNA的浓度及纯度，比值为1.8~2.1者可用于进一步实验。采用Westernblot法及qRT-PCR对转染后PANC-1细胞中NDRG1在蛋白水平及mRNA水平表达的转染效率进行检测。并采用Westernblot法及qRT-PCR对PANC-1细胞siNDRG1转染后MMP-7在蛋白水平及mRNA水平表达进行检测。

1.1.4MTT法检测转染后PANC-1细胞增殖取各组PANC-1细胞，按MTT试剂盒操作步骤，以5×103细胞/孔密度接种于96孔细胞培养板内，并设立3个复孔，培养24、48、72、96、120h后，每孔内加入5mg/mLMTT液2μL，继续进行温育4h，弃上清后加入DMSO150μL，进行振荡溶解结晶，比色选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上进行各孔光吸收值测定，并重复3次试验，取平均值。

1.1.5流式细胞仪检测转染后PANC-1细胞调亡PANC-1细胞进行转染48h后，取各组细胞，依照AnnexinV-FITC/PI试剂盒说明书步骤进行操作，流式细胞仪AlexaFITC最大激发波长488nm，最大发射波长为509nm，PI-DNA复合物最大激发波长为535nm，最大发射波长为615nm，采用软件CellQuest进行分析。AlexaFITC为X轴，PI为Y轴，每个样本采集为10000个细胞，区分开早期调亡细胞、晚期调亡细胞及继发坏死细胞区，计算出阳性细胞的百分比例，并重复3次试验，取平均值。

1.2统计学处理采用PASWStatistics18.0软件进行统计分析，率的比较采用χ2检验，Westernblot、qRT-PCR及MTT结果采用GraphPadPrism6.0进行单因素方差分析及作图，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1胰腺癌细胞株的Westernblot法检测结果NDRG1（60kDa）在PANC-1、BXPC-3、CAPAN-2、SW1990细胞株中均有表达，低分化细胞（PANC-1）中NDRG1蛋白水平表达较中分化（BXPC-3）及高分化细胞株（CAPAN-2、SW1990）高，差异均有统计学意义（PANC-1vs.BXPC-3：q=3.4，P<0.05；PANC-1vs.CAPAN-2：q=7.23，P<0.01；PANC-1vs.SW1990：q=8.65，P<0.01）；MMP-7（28kD）在4种细胞株中表达与NDRG1的趋势一致（PANC-1vs.BXPC-3：q=3.5，P<0.05；PANC-1vs.CAPAN-2：q=9.27，P<0.01；PANC-1vs.SW1990：q=10.58，P<0.01）。

2.2各细胞株的qRT-PCR检测4组细胞株中NDRG1及MMP-7在mRNA水平均有表达，低分化细胞（PANC-1）中NDRG1在mRNA水平表达较中分化（BXPC-3）及高分化细胞株（CAPAN-2、SW1990）高，差异均有统计学意义（PANC-1vs.BXPC-3：q=3.15，P<0.05；PANC-1vs.CAPAN-2：q=9.35，P<0.01；PANC-1vs.SW1990：q=9.95，P<0.01）；MMP-7的mRNA在4种细胞株中表达趋势与NDRG1一致（PANC-1vs.BXPC-3：q=3.27，P<0.05；PANC-1vs.CAPAN-2：q=8.66，P<0.01；PANC-1vs.SW1990：q=9.17，P<0.01）。

2.3Westernblot及qRT-PCR对siNDRG1转染效果的检测Westernblot与qRT-PCR结果显示，siNDRG1转染组PANC-1细胞NDRG1蛋白与mRNA表达水平均明显低于空白对照组（均P<0.05），但阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（均P>0.05）（图3）。

2.4siNDRG1转染后MMP-7蛋白与mRNA表达变化Westernblot结果显示，siNDRG1转染组PANC-1细胞MMP-7蛋白与mRNA表达水平均明显低于空白对照组（均P<0.05），但阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（均P>0.05）（图4）。2.5MTT检测siNDRG1干扰后PANC-1细胞增殖变化空白对照组、siNDRG1转染组与阴性对照组PANC-1细胞增殖率72h：（62.53±9.45）%、（42.26±10.24）%、（59.87±6.19）%；96h：（83.26±6.47）%、（51.39±11.29）%、（79.98±7.04）%；120h：（84.67±7.12）%、（61.57±4.38）%、（81.43±7.84）%。siNDRG1干扰后PANC-1细胞增殖能力受到抑制，在72、96、120h与空白对照组比较，差异均具有统计学意义（t=9.454，P<0.01；t=12.367，P<0.01；t=3.733，P<0.05），而阴性对照组与空白对照组在各时间点差异均无统计学意义（均P>0.05）2.6流式细胞仪检测siNDRG1干扰后PANC-1细胞调亡变化siNDRG1组、空白对照组、阴性对照组PANC-1细胞凋亡率分别为17.59%、0.45%、0.24%，siNDRG1组与阴性对照组或空白对照组比较，调亡率明显增高，差异均有统计学意义（均P<0.05），阴性对照组或空白对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。

3讨论

胰腺癌以发现晚、治疗效果差、预后差及病死率高为特点。经多中心研究显示，胰腺癌的1年生存率低于20%，5年生存率低于5%。80%以上的患者在确诊时已经发生广泛转移。患者均死于癌肿恶性生长、转移及浸润。胰腺导管腺癌在胰腺癌病理分型中占80%~90%[11]。目前无论是手术、放疗及化疗均不能显著提高患者的生存率。针对胰腺癌相关基因靶向治疗是目前的研究热点。胰腺癌的发生及发展是多基因的协同作用的结果。本研究显示，在蛋白水平，NDRG1及MMP-7在PANC-1、BXPC-3、CAPAN-2、SW19904组细胞株中均有表达，在低分化细胞PANC-1中NDRG1在蛋白水平表达较中分化BXPC-3及高分化细胞株CAPAN-2、SW1990中高，提示，NDRG1及MMP-7可能参与恶性肿瘤细胞的生长及分化行为，NDRG1及MMP-7表达上调会导致胰腺癌细胞分化程度差，恶性度增高。在mRNA水平，NDRG1及MMP-7在PANC-1表达较BXPC-3及CAPAN-2、SW1990中高，提示NDRG1及MMP-7对胰腺癌细胞分化及恶性生长行为的调节在基因水平即已发生。NDRG1作为α/β水解酶，具有磷酸泛酰巯基乙胺序列，能够活化氨基酸及脂肪酸，在细胞生长分化及细胞周期中起到重要作用，参与肿瘤细胞的蛋白水解代谢，从而促进肿瘤细胞的分化潜能，细胞周期从G1期向G2期转化。NDRG1没有水解酶的催化位点，受N-myc的抑制。NDRG1位于人染色体8q24，全长约60kb，包含着16个外显子及15个内含子，C末端包含3段特有的具有10个亲水性氨基酸残基串联重复序列。基质金属蛋白酶作为蛋白水解酶家族，在肿瘤形成微环境中起到重要作用。

本研究采用siRNA转染胰腺癌PANC-1细胞株，经Westernblot及qRT-PCR在蛋白及mRNA水平证明沉默效率达到60%以上，成功的下调了NDRG1在PAN-1细胞中的表达。NDRG1下调后，经Westernblot及qRT-PCR检测发现，MMP-7在蛋白及mRNA水平表达下调[10]。NDRG1对恶性肿瘤生长分化等恶性行为的调控可能通过调控MMP-7表达实现，MMP-7可与NDRG1的辅基酰基载体蛋白结合形成复合体从而影响恶性肿瘤的行为，NDRG1也可能上调MMP-7表达从而通过水解活性促进胰腺癌细胞从原发灶脱落、迁移，在远隔器官种植浸润。MMP-7以酶原形式产生，激活后即形成IV型胶原酶，从而降解、破坏靠近肿瘤表面细胞外基质中I型、III型胶原，诱发肿瘤细胞沿缺失的基膜环形侵润，结果即为恶性肿瘤细胞的侵袭转移[18]。MMP-7可以与NDRG1的辅基酰基载体蛋白结合，两者以复合体形式存在并激活，从而影响胰腺癌的生长分化、凋亡增殖等恶性行为。

MTT显示，siNDRG1干扰后PANC-1细胞增殖能力受到抑制，在72、96、120h均低于空白对照组，NDRG1表达下调后PANC-1细胞的增殖能力明显受到抑制，流式细胞检测也显示，siNDRG1干扰后PANC-1细胞凋亡率升高，并以早期凋亡为主，NDRG1过表达可能抑制肿瘤细胞凋亡，对其进行敲除后胰腺癌细胞凋亡增加。NDRG1通过与靶基因3''''端非翻译区的不完全配对抑制靶基因mRNA的翻译或降解，从而参与细胞分化、增殖、发育、凋亡、代谢生物过程[19]。NDRG1对胰腺癌细胞增殖及凋亡的调控作用可能与对MMP-7表达的调控密切相关，需进一步实验证明。本研究显示，NDRG1表达上调对胰腺癌细胞的分化、增殖及凋亡具有调控作用。NDRG1对胰腺癌细胞的调控作用可能通过MMP-7表达实现。本研究可能为胰腺癌治疗提供新的靶点，为胰腺癌的治疗提供新的思路。

作者：张小薄高峰谭晓冬周磊王怀涛石刚单位：中国医科大学附属盛京医院普通外科辽宁省肿瘤医院大肠外科