肿瘤癌细胞论文范文

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1材料和方法

1.1半定量RT-PCR检测VEGF的表达提取RNA方法如下：将50mL细胞培养瓶中细胞达到80%融合时，倒掉培养液，加入1mLTrizol。将培养瓶内Trizol吸取至1mLEP管中，室温静置5min。加入200μL氯仿，剧烈摇晃数次，室温静置5min，11000转/分，4℃离心15min。取上清液加入新1mLEP管中，加入500μL异丙醇后摇晃数次。室温静置10min，11000转/分，4℃离心10min。弃上清液加1mL75%乙醇后混匀。7500转/分，4℃离心5min。弃上清液风干，加入20μL无RNA酶水，58℃加温10min，-70℃冻存。将mRNA逆转录成cDNA，50μL反应体系PCR反应。VEGF（682bp）引物序列：5''''ggctctagatcgggcctccgaaaccat3''''和5''''ggctctagagcgcagagtctcctcttc3'''';β-actin（434bp）引物序列：5''''tgtgcccatctacgaggggtatgc3''''和5''''ggtacatggtggtgccgccagaca3''''。反应条件：95°C变性，30s；VEGF63.5°C退火，27循环，45s；或β-actin57°C退火，25循环，30s；72°C延伸30s。收集PCR产物1.5%琼脂糖电泳。凝胶成像系统半定量分析。以上结果均重复3次。

1.2统计学处理采用SPSS11.5统计软件进行统计处理，计量指标用（x軃±s）表示，ANOVA方差分析，student-Newman-Keuls检验，方差齐性检验进行显著性检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1细胞毒性活力检测ACC-M和ACC-2细胞在不同浓度的SNAP作用4h后细胞的活力，在0μmol/L~500μmol/L浓度的SNAP作用下，细胞的活力均保持在88%以上（表1）。经浓度100ng/mL的LPS预刺激12h后，用500μmol/L的SNAP分别作用不同时间ACC-M和ACC-2细胞活力，其活力均保持在86%以上。

2.2不同浓度SNAP对ACCs细胞中VEGF的mRNA表达水平的影响半定量RT－PCR的结果表明（图1、图2），在31.25μmol/LSNAP刺激下ACC-M和ACC-2细胞中VEGF的mRNA平均水平显著升高，为2.32±0.10和2.14±0.15，分别是对照组细胞（0μmol/L）mRNA水平的4.14倍和6.90倍，差异有统计学意（P<0.01）。随着SNAP刺激浓度升高，mR－NA水平逐渐回落：62.5μmol/LSNAP仍可明显上调VEGF的mRNA水平（P<0.01），但不及31.25μmol/L的SNAP显著；125μmol/L和250μmol/LSNAP对VEGFmRNA影响差异无统计学意义；而500μmol/LSNAP则显著下调ACCs细胞中VEGF的mRNA水平（P<0.01），仅为基础mRNA水平的0.23倍和0.17倍（表3）。One－WayANOVA检验和Student–Newman-Keuls检验比较31.25μmol/L、62.5μmol/L及500μmol/L浓度组与0对照组mRNA表达差异有统计学意义。

2.3SNAP时间依赖性抑制100ng/mLLPS诱导的VEGF的表达水平随着500μmol/LSNAP作用时间的延长，ACCs细胞中LPS诱导的VEGFmRNA水平显著下降（P<0.01）；当500μmol/LSNAP作用4h后，仅可检测到极微弱的VEGFmRNA条带，其mRNA的平均表达水平显著低于LPS诱导12h后SNAP作用0小时组的mRNA水平（表4）。半定量RT－PCR的结果（见图3、图4）。One－WayANOVA检验和Student-Newman-Keuls检验比较其他各时间组与0对照组mRNA表达差异有统计学意义（P<0.05）。

3讨论

一氧化氮（NO）是一种极不稳定的生物自由基，其生成依赖于细胞内的一氧化氮合成酶（nitricoxidesynthaseenzyme，NOS）。它能通过传递电子的反应参与机体的氧化还原反应，在生物体内发挥重要生理作用。目前越来越多的研究证实，NO在肿瘤细胞中发挥着双向调节的作用。研究发现，肿瘤微血管内皮细胞和肿瘤基质细胞中NOS的高表达，能抑制肿瘤的生长和局部浸润。而另一些研究表明，NO具有促进肿瘤血管发生和局部侵袭性。不同的NO浓度是其在肿瘤调控中发挥着截然相反作用的主要原因。高浓度的NO在生物体内形成过氧亚硝基（OONO-）和N3O2，能氧化或硝化DNA导致DNA单链断裂、抑制DNA的合成以及核苷酸还原酶的活性，并能抑制体内的磷酸化信号通路的活化促进肿瘤细胞的凋亡。而低浓度的NO被证实与肿瘤微血管发生、肿瘤浸润和转移相关。因此将NO作为肿瘤治疗的重要手段的同时，应充分认识低浓度的NO对肿瘤促进作用。本实验证明NO的供体SNAP对ACCs细胞有着双向调控作用，当SNAP的刺激浓度在31.25μmol/L时能显著上调血管发生相关因子的表达，而当SNAP的刺激浓度在500μmol/L时血管发生相关因子的表达被有效抑制。

大量研究证明，NO诱导的血管发生相关因子的异常表达，在促进肿瘤微血管发生方面发挥着重要的作用。Jenkins等[8]首次报道在人肿瘤细胞中，转入iNOScDNA阅读框后肿瘤生长加速，且伴随着大量微血管的发生。Ambs等的实验证实，在异种种植瘤内NO能诱导VEGF表达增高，促进肿瘤微血管发生。可见在ACC中，相对低浓度的NO可能通过上调VEGF表达来促进肿瘤微血管发生。

随着对NO的抗肿瘤特性研究的逐渐深入，NO被视为一种颇具前景的肿瘤细胞杀伤因子，然而NO对肿瘤调控的双向效应增加了其作为抗肿瘤药物的复杂性。因此研究不同浓度NO对ACCs细胞的调控作用和调控途径，将更加有利于研究其对ACCs的抑制作用。本实验结果发现，当SNAP浓度为31.25μmol/L时，ACCs细胞中VEGF表达显著增高。当SNAP浓度为500μmol/L时，LPS诱导的VEGF的高表达被明显抑制，且具有时间依赖性。提示500μmol/LSNAP能有效抑制ACCs血管发生相关因子的表达，提示高浓度NO可能在抑制ACCs血管发生过程中发挥着重要的作用。

作者：陈锦袁苏健单位：长江航运总医院武汉脑科医院口腔科