叶酸抑制胃癌细胞论文范文

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1实验资料

1.1实验分组按事先转染的成分不同以及后续培养基不同分为先行PLK－1siRNA干扰然后在无叶酸培养基中培养72h组(Null+PLKS组)、先行PLK－1siRNA干扰然后在正常叶酸浓度培养基中培养72h组(Control+PLKS组)、无PLK－1siRNA而用PBS作对照的转染然后在无叶酸培养基中培养72h组(Null+PBS组)、无PLK－1siRNA而用PBS作对照的转染然后在正常叶酸浓度培养基中培养72h组(Control+PBS组)。

1.2实验方法

1.2.1PLK－1siRNALipofectamineTM2000的转染转染过程严格按照说明书施行。其基本步骤为:转染前24h，在每块6孔板的每个孔内用2mL不含双抗的RPMI1640培养基接种对数生长期的肿瘤细胞5×105个。经过24h，细胞融合度为40%。用250μLOpti－MEM培养基稀释siRNA(siRNA的量为100pmol)，混匀。用250μLOpti－MEM稀释5．0μLLipofectamineTM2000，混匀，室温下静置5min。将以上混合转染试剂和siRNA稀释液混匀，室温下静置20min。转染复合物加入到6孔细胞板中，前后轻摇细胞板混合均匀。转染6h后换新鲜培养基。

1.2.2Real－timePCR和Westernblot验证PLK－1siRNA干扰的效果细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养72h，然后用RIPA和Trizol分别提取蛋白和RNA。蛋白以GAPDH为内参，用Westernblot检验其表达差别。siRNA经反转录成cDNA后行Real－time检测PLK－1siRNA的转录水平差别。PLK－1和GAPDH的引物由上海生工合成，引物序列见表1。

1.2.3CCK－8检测细胞增殖情况经不同PLK－1siRNA干扰或者PBS作为对照的干扰组，6h后，胰酶消化收集细胞，将其按96孔板每个孔2000个细胞的密度接种，每次取5复孔，按4组要求分别加入正常叶酸浓度的培养基和不含叶酸的培养基后，分别培养72h，然后弃去培养基，分别加入上述对应的培养基100mL和CCK－810μL的混合液，在培养箱内孵育3h，检测吸光度，观察细胞增殖情况。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡和增殖情况在6孔板转染后，经不同PLK－1siRNA干扰或者PBS作为对照的干扰组，干扰6h后吸去干扰液，按4组要求分别加入正常叶酸浓度的培养基和不含叶酸的培养基，培养72h。收取上清液中的悬浮细胞+胰酶消化后的细胞，离心，PBS洗2次。然后按AnnexinV试剂盒操作流程染色。实验总共设一个阴性对照管、AnnexinV和PI单染管和实验管，每管细胞约1×106。室温避光孵育15min，流式上机检测细胞凋亡情况。对于周期，收集的各组细胞加入70%(PBS稀释)－20℃无水乙醇2～3mL，4℃固定6h以上。1500r/min去上清，1mLPBS1500r/min5min清洗1遍，加入200μLPBS重新悬浮，调整细胞浓度为106～107，加入1%的Rnase60μL，37℃摇床水浴30min。加入20μL250μg/mL的PI，室温避光孵育10min上机检测。

1.2.5Westernblot检测Bcl－2表达情况RIPA提取蛋白后，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物研究所)测定蛋白浓度，调整浓度后用SDS上样缓冲液加热变性后，蛋白电泳检测蛋白表达差异。

1.3统计学方法使用SPSS19．0软件包进行统计处理。所有结果用均数±标准差(x珋±s)表示。各组间差异比较使用析因方差分析，多组间均数比较采用F检验，均数间的两两比较采用q检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组PLK－1mRNA水平和蛋白表达情况转染72h后检测PLK－1mRNA和蛋白的表达情况。Real-timePCR检测发现胃癌细胞系SGC7901和BGC823，PLK－1mRNA在用PLK－1siRNA干扰的PLKS组较PBS干扰的PBS组明显降低，见图1。同样，在蛋白表达水平上，Westernblot显示经PLK－1siRNA干扰，胃癌细胞系SGC7901和BGC823的PLK－1蛋白水平也明显降低，见图2及图3。

2.2各组SGC7901和BGC823细胞增殖情况比较在接种相同数目细胞的前提下，细胞数目少反映PLKS组细胞增殖较慢。析因方差分析显示叶酸缺乏和PLK－1siRNA对SGC7901和BGC823细胞增殖均有明显影响，且叶酸缺乏和PLK－1siRNA对胃癌细胞系SGC7901和BGC823有交互作用(P值分别为0．046和0．006)。因Null－PLKS组均数＜Null－PBS组均数+Control－PLKS均数－Control－PBS组均数(SGC7901和BGC823细胞系计算值分别为0．227＜0．316和0．309＜0．485)，所以叶酸缺乏和PLK－1对胃癌细胞系SGC7901和BGC823的增殖抑制具有协同作用。

2.3各组SGC7901和BGC823细胞凋亡情况比较AnnexinV检测细胞凋亡情况，流式图横坐标为标FITC的AnnexinV，纵坐标为PI。SGC7901的早期凋亡(Q4象限)在Null－PLKS组、Null－PBS组、Control－PLKS组和Control－PBS组分别为(26．42±1．50)%，(5．13±1．24)%，(10．17±1．76)%和(6.17±2．47)%。BGC823的早期凋亡(Q4象限)在Null－PLKS组、Null－PBS组、Control－PLKS组和Control－PBS组分别为(24．28±2．90)%，(6．88±2．05)%，(13．30±2.58)%和(5.80±3．01)%。析因方差分析得出，PLK－1siRNA能促进凋亡，但叶酸缺乏对凋亡影响不大;叶酸缺乏与PLK－1siRNA之间有交互效应。因Null－PLKS组均数＜Null－PBS组均数+Control－PLKS均数－Control－PBS组均数(SGC7901和BGC823细胞系计算值分别为:26．42＞9.13和24．28＞14．38)，所以叶酸缺乏能增强PLK－1对胃癌细胞系SGC7901和BGC823的促凋亡作用。

2.4各组SGC7901和BGC823细胞周期情况SGC7901G2/M比例在Null－PLKS组、Null－PBS组、Control－PLKS组和Control－PBS组分别为(20．88±2．55)%，(8．32±2．18)%，(19．49±1．98)%和(7．48±1．68)%;BGC823G2/M比例在各组分别为(22．95±2．71)%，(11．61±2．66)%，(22．01±2．94)%和(10．03±2．47)%。对数据进行统计，发现PLK－1siRNA能提高G2/M比例(P＜0．05)，但叶酸缺乏不能，而且叶酸缺乏和PLK－1siRNA之间也无交互作用(P＞0．05)。见图6及图7。

2.5各组SGC7901和BGC823细胞Bcl－2蛋白表达情况叶酸缺乏和PLK－1siRNA均能降低Bcl－2的表达，而且叶酸缺乏和PLK－1siRNA对BCL－2的表达有交互效应(P＜0．05)。鉴于两者Null－PLKS组均数＞Null－PBS组均数+Control－PLKS均数－Control－PBS组均数，叶酸缺乏和PLK－1siRNA具有拮抗作用。

3讨论

肿瘤是一个全身性疾病，手术对肿瘤尤其是中晚期肿瘤其是胃癌治疗效果有限。基于肿瘤发生、发展机制的综合治疗，尤其是联合治疗有其特有的优势。PLK－1作为PLK家族中被研究最多的一员，不仅在很多肿瘤中表达升高，而且它的升高还对诸如胃癌、结直肠癌的预后判断具有价值。PLK－1参与了数个至关重要的有丝分裂步骤，如激活CDC25c磷酸化酶、调节有丝分裂过程等。PLK－1具有参与多个肿瘤发生、发展步骤的特点。所以，PLK－1被认为是重要的分子靶标，并被广泛关注。Bcl－2是一个经典的抗凋亡蛋白，降低Bcl－2能促进肿瘤凋亡，抑制肿瘤生长。本实验运用PLK－1的siR-NA敲低PLK－1后，胃癌细胞系SGC7901和BGC823的增殖降低，凋亡增加，细胞阻滞在G2/M期，且叶酸缺乏联合PLK－1siRNA能抑制Bcl－2的表达，提示降低PLK－1可能通过Bcl－2途径起作用，这与其他研究的结果类似。叶酸是生物体代谢重要的一碳单位，叶酸类似物如甲氨蝶呤被用作肿瘤的治疗。本研究证实PLK－1siRNA能抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡，叶酸缺乏也能抑制肿瘤的增殖，且叶酸能协同PLK－1siRNA抑制肿瘤细胞增殖和促进细胞凋亡。但在抑制胃癌细胞Bcl－2的表达上有拮抗作用。

笔者认为，这可能与蛋白的作用往往不是与浓度呈线性关系有关，该结果有待进一步研究。叶酸缺乏和PLK－1siRNA协同抑制肿瘤的意义在于，使用PLK－1抑制剂时补充叶酸，尤其是大量补充应慎重。不仅如此，PLK－1抑制剂联合临床使用的抗叶酸制剂，如甲氨蝶呤、普拉曲沙(pralatrexate)等，能否达到更好治疗肿瘤的目的也值得深入研究。

作者：查小应黄磊杨木清欧敬民陈大伟费哲为单位：上海交通大学医学院附属新华医院上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院