空载纳米粒子胆管癌细胞论文范文

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1材料与方法

1.1空载纳米粒子体外溶血试验在红细胞悬浮液中加入蒸馏水，由于渗透压差异导致红细胞破裂作为阳性对照，在红细胞悬浮液中加入PBS使得红细胞不破裂作为阴性对照组，选取两种高浓度（2mg/mL、1mg/mL）的空载纳米粒子进行了溶血测试。

1.25-FU-PCL-NP的体外释药研究使用分光光度计对5-FU溶液进行200~400nm的全波长扫描，确定了5-FU在水相环境下的最大吸收波长为266.4nm，调整至标准曲线模式，分别选择最大吸收波长作为光源，进行5-FU标准曲线的绘制，通过这条标准曲线，药物释放环境下，分别于0、12、24、36、48、72h测得吸光度值，并根据标准曲线计算释药量，绘制释药曲线。

1.3细胞培养Hccc-9810细胞在含10%胎牛血清的1640培养基中，37℃，5%CO2饱和度下培养。

1.4CCK-8法测定肿瘤细胞增殖抑制实验取处于对数生长期的Hccc-9810细胞，接种于96孔板，调节细胞浓度，使每孔细胞数为8000个，37℃，5%CO2饱和度下培养箱孵育过夜，待细胞贴壁后，分按空白NP组，单纯5-FU组，5-FU-PCL-NP组（按载药率折算5-FU的量），分别按5-FU药物浓度0、5、10、15、20、40、80μg/mL，每个浓度组设立5个复孔，共培养48h，后均用CCK-8法检测各孔存活细胞吸光度。细胞存活率=（处理组OD值-空白对照组OD值）/（对照组OD值–空白对照组OD值）×100%。同时计算半数有效浓度（IC50）值。

1.5流式细胞仪检测细胞凋亡率取处于对数生长期的Hccc-9810细胞，接种于6孔板，调节细胞浓度，使每孔细胞数为2×105个，将细胞分为：空白对照组、空载纳米粒组、单纯5-FU组、5-FU-PCL-NP组；根据CCK-8实验所筛选出半数有效浓度，按5-FU1.5μg/mL分别加药共培养细胞48h，用不含EDTA的胰酶消化收集收集6孔板细胞，PBS清洗2遍，加入500μL的结合缓冲液悬浮细胞，加入分别5μLAnnexinV，5μLPropidiumIodide混匀；避光，室温下反应15min，后上机检测细胞凋亡率。

1.6统计学处理所有实验均重复3次，统计资料结果以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法，P<0.05表示差异有统计学意义。使用SPSS19.0软件进行统计分析。

2结果

2.15-FU-PCL-NP形态观察透射电镜照片所示，5-FU-PCL-NP呈现出完好的球形形态，分布均匀无粘连情况，表明成功合成相关载药纳米材料，并且结构稳定（图1）。

2.2空载纳米粒子体外溶血试验体外溶血试验结果显示，阳性对照组出现明显溶血，阴性对照组及2个浓度的空载纳米粒子组均未出现溶血。

2.35-FU载药纳米粒子的体外药物释放体外释药实验结果显示，单纯5-FU在8h内即达峰值；而5-FU-PCL-NP的释放比较平缓，在前24h达50%，在72h后达到62.9%（图3）。

2.45-FU-PCL-NP对Hccc-9810细胞增殖抑制作用单纯5-FU及5-FU-PCL-NP分别按按5-FU药物浓度0、5、10、15、20、40、80μg/mL与Hccc-9810细胞共培养48h之后，细胞活性随药物浓度上升而下降，5-FU-PCL-NP组对细胞的增殖抑制作用明显强于单纯5-FU（P<0.05）。5-FU-PCL-NP组与单纯5-FU组的IC50分别为（1.32±0.12）μg/mL和（2.5±0.39）μg/mL，差异有统计学意义（P<0.05）（图4）。

2.5流式细胞仪检测细胞凋亡率流式细胞仪检测结果显示，空白对照组和空载纳米粒子组凋亡率分别为（6.5±2.4）%、（7.2±3.1）%，两组间差异无统计学意义（P>0.05）；5-FU-PCL-NP组凋亡率为（37.5±4.5）%，而单纯5-FU组细胞凋亡率分别为（26.4±3.2）%，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）（图5）。

3讨论

胆管癌是消化道较常见的恶性肿瘤之一，发病率呈上升趋势，由于其恶性程度高，早期诊断困难，且因其周围解剖结构复杂，容易向周围组织侵润，手术R0切除率低（约15%~20%），预后较差，因此近年来针对胆管癌的非手术治疗逐渐成为研究的热点。

5-FU为治疗消化道恶性肿瘤的经典药物，Thongprasert等报道以5-FU为基础的化疗组患者对胆管癌控制率可达50%。但其治疗剂量较大，为增强疗效而加大剂量会带来毒性作用，临床上患者表现为强烈的化疗后副反应，往往不易耐受。因此通过药物的缓释，减慢药物代谢，增加作用时间窗，提高疗效具有重要的临床意义。

纳米微球由于粒径小、比表面积大，具有特殊的体积效应和表面效应，使之具有特殊的表面性能，包括生物黏附性、电性、亲和性等，这有利于增加所载药物在吸收部位的接触时间和接触面积，加之其对药物具有明显的保护作用，故可大大提高药物的吸收和生物利用度，并可延长其在体内的循环时间，大大增加作用时间窗。聚己内酯材料是一种新型的生物可降解材料，本实验合成了5-FU-PCL-NP，其载药率为15.1%，包封率为41.9%，并通过透射电镜证明了其成功合成，具有稳定的形态，同时体外药物缓释实验结果表明单纯5-FU在前8h即达峰值，而5-FU-PCL-NP的释放在前24h达50%，说明具有一定突释作用，后释放趋于平稳，至72h后达到62.9%，表明该材料具有良好的药物缓释作用。体外溶血试验结果表明，高浓度的纳米材料也不会引起细胞的溶血，证明了其较好的生物安全性。CCK-8增值抑制实验表明5-FU-PCL-NP对肿瘤细胞的增值抑制作用优于单纯5-FU，进一步应用流式细胞仪检测凋亡，结果提示5-FU-PCL-NP明显促进了肿瘤细胞的凋亡，表明载药纳米粒子在细胞吸收后，通过缓释作用，增强了作用时间，促进肿瘤细胞的凋亡增强了药物的杀伤作用。

综上所述，5-FU-PCL-NP具有良好的生物安全性，缓释作用，可以明显增强药物的抑制增殖效果，并能诱导人胆管癌细胞的凋亡。本研究结果为载药纳米给药系统的开发和应用提供了一定的实验基础，为胆管癌的药物治疗提供了新的思路，同时随着后期相关官能团的修饰，可以进一步实现肿瘤的靶向治疗，对于改善胆管癌患者的预后具有重要意义。

作者：李永盛贺思佳江翰边睿王硕郝袁王雪峰刘颖斌徐雷鸣施伟斌单位：上海交通大学医学院附属新华医院普通外科胆道研究所消化内科